多年生黑麦草表皮细胞切片的制备方法技术

本发明专利技术涉及实验用具，具体公开了一种多年生黑麦草表皮细胞切片的制备方法，所述方法包括：(1)选取多年生黑麦草叶片，投入FPA固定液中固定至少24小时，取出进行徒手切片，获得待观察多年生黑麦草叶片；(2)冲洗叶片表面残留的固定液，刮去叶片一侧表皮及部分叶肉后，投入浓度为0.9～1.1％的混合酶液中，在26～28℃条件下解离1～3h后，清洗去除混合酶液；(3)刮去残存组织，直至叶片表皮呈现透明状，即得多年生黑麦草表皮细胞切片；其中，所述混合酶液中含有等质量比的果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶。通过本发明专利技术方法可以获得完整且视野清晰的多年生黑麦草叶片表皮细胞切片，可以在显微镜下观察到清晰的气孔、表皮细胞结构、表皮毛等附属器官。

Method for preparing epidermal cell section of perennial ryegrass

The present invention relates to experimental equipment, specifically discloses a preparation method of perennial ryegrass epidermal slices, the method comprises the following steps: (1) selection of perennial ryegrass, put FPA fixative fixed at least 24 hours, take out the hand sliced, get to observe the annual ryegrass leaf; (2) washing liquid fixed the blade surface residues, scraping the leaf epidermis and mesophyll side part, input concentration of 0.9 to 1.1% in the mixed enzyme solution, at 26 to 28 DEG C under the condition of dissociation of 1 ~ 3H, remove the mixed enzyme liquid; (3) scraping the residual tissue, until the leaf epidermis is translucent, perennial ryegrass epidermal cells slice; among them, the mixed enzyme solution containing mass ratio of pectinase, cellulase and hemicellulase. By the method of the invention, leaf epidermis cells of perennial ryegrass leaves with complete and clear visual field can be obtained, and clear stomata, epidermal cell structures, epidermal hairs and other accessory organs can be observed under the microscope.

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及实验用具领域，具体地说，涉及一种显微观察的细胞切片。
技术介绍
多年生黑麦草是一种重要的冷季型草坪草种，原产于欧洲、温带亚洲和北非。黑麦草适宜无严冬酷夏的凉爽环境。作为草坪建植的重要草种之一，多年生黑麦草成坪快，耐低修剪，能够形成致密的草皮，常作为冷季型混播草坪先锋草种建植足球场草坪，也可以用作补播和交播材料。同时，叶片油亮，色泽墨绿的特点，也使其广泛应用于景观草坪、运动场草坪以及高尔夫球场球道草坪。由于多年生黑麦草应用广泛，叶片形态与生理特性具有相关性，因此研究人员需要对其叶片表皮细胞进行观察。叶片表皮细胞特征观察包括细胞数量、大小、形态、细胞分类(如：长细胞、短细胞)、表皮毛数量、大小、形态以及气孔数量、大小、形态等特征的观察。不同品种多年生黑麦草叶片表皮细胞形态存在一定的差异，而这种差异有可能造成不同品种多年生黑麦草间的生理抗性的差异。因此，观察和研究多年生黑麦草表皮细胞具有重要的意义。有大量研究人员通过直接刮取草坪草叶片表面制作徒手切片，观察草坪草叶片表皮细胞。但这种方法并不适用于多年生黑麦草，多年生黑麦草叶片含水量较多，表皮细胞排列紧密，通过直接刮表皮无法获得完整表皮细胞，同时，会存留大量叶绿素，影响视野清晰度及表皮细胞的完整性。多年生黑麦草叶片表面含有蜡质，表皮毛等附属器官，保护叶片表皮，因而使得叶片表皮切片的制作具有困难。透明胶带法和指甲油印迹法都是通过利用透明胶带和指甲油对叶片表面的粘合性撕取叶片表皮细胞，制成装片进行显微观察。但这两种方法缺点明显，首先，多年生黑麦草叶片表皮蜡质较多，使得透明胶带和指甲油对叶片表面的粘合性不强，无法获取多年生黑麦草完整的表皮细胞；其次，撕取部分表皮细胞后，会将大量的叶绿素一同撕取下来，造成观察过程中的视野阻碍，影响表皮细胞观察清晰度。次氯酸离析叶片表皮细胞的方法是通过离析法，离析叶片表皮细胞与叶肉，撕取表皮细胞后，进行染色，制成装片观察。此种方法的缺点为，使用次氯酸钠会对多年生黑麦草叶片表皮细胞造成不可逆的损伤，破坏程度随次氯酸钠浓度的增加而加深，但离析效果同样因次氯酸钠浓度的增加效果更加显著，这便造成了互相矛盾的结果。因此，亟需开发一种适用于多年生黑麦草的叶片表皮细胞徒手切片制作方法，在对表皮细胞伤害程度尽可能小的基础上，快速获得完整、且视野内清晰度高的表皮细胞徒手切片。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术的目的是提供一种多年生黑麦草表皮细胞切片的制备方法。为了实现本专利技术目的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术首先提供一种多年生黑麦草表皮细胞切片的制备方法，包括如下步骤：(1)选取多年生黑麦草叶片，投入FPA固定液中固定至少24小时，取出进行徒手切片，获得待观察多年生黑麦草叶片，(2)冲洗叶片表面残留的固定液，刮去叶片一侧表皮及部分叶肉后，投入浓度为0.9～1.1％的混合酶液中，在26～28℃条件下解离1～3h后，清洗去除混合酶液；具体而言，若欲观察叶片上表皮，则刮去叶片下表皮及部分叶肉，若欲观察叶片下表皮，则刮去叶片上表皮及部分叶肉；(3)刮去残存组织，直至叶片表皮呈现透明状，即得多年生黑麦草表皮细胞切片；其中，所述混合酶液中含有等质量比的果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶。即果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶按1:1:1的质量比组成混和酶。作为优选，所述混合酶液中混合酶的浓度为1％，溶剂为pH5.7的PBS缓冲液。所述浓度为1％理解为每100mL的混合酶液中含有1mg的混和酶，前述浓度为0.9～1.1％的混合酶液理解为每100mL的混合酶液中含有0.9～1.1mg的混和酶。由于本专利技术通过试验发现了最佳的混和酶浓度为1％，对于本领域技术人员来说，在此基础上进行些许微量的调整(浓度为0.9～1.1％)也同样能够实现本专利技术的技术效果。所述FPA固定液、PBS缓冲液、果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶为本领域常规使用试剂与酶类，均属于市售可得的商品，本专利技术对此不另作限定。作为优选，所述步骤(2)中，在26～28℃水浴环境中解离，水浴环境将提供更佳良好的恒温效果，利于解离。更为优选，在27℃水浴环境中解离2h，能够得到最佳的解离效果。进一步地，所述步骤(1)中，投入FPA固定液中固定24～48小时固定效果较佳。按照上述方法制备得到的多年生黑麦草表皮细胞切片，可以在显微镜下观察到清晰的气孔、表皮细胞结构、表皮毛等附属器官。基于此，由上述方法制备得到的多年生黑麦草表皮细胞切片也在本专利技术的保护范围之内。本专利技术的有益效果在于：本专利技术提供一种多年生黑麦草表皮细胞切片的制备方法，通过该方法可以获得完整且视野清晰的多年生黑麦草叶片表皮细胞切片，可以在显微镜下观察到清晰的气孔、表皮细胞结构、表皮毛等附属器官。附图说明图1为本专利技术实验例1中实施例1所得切片的显微观察图。图2为本专利技术对比例1中试验组2所得切片的显微观察图。图3为本专利技术对比例1中试验组3所得切片的显微观察图。图4为本专利技术对比例1中试验组4所得切片的显微观察图。具体实施方式下面将结合实施例对本专利技术的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本专利技术的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本专利技术的宗旨和精神的情况下，可以对本专利技术进行各种修改和替换。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1本实施例以制备多年生黑麦草上表皮细胞切片为例，用于说明本专利技术所述的多年生黑麦草表皮细胞切片的制备方法。具体操作如下：1、制备混合酶液：将果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶按照1:1:1的比例混合，溶于pH5.7的PBS缓冲液中，制备得到浓度为1％混合酶液(每300mL混合酶液中，含有1mg果胶酶、1mg纤维素酶和1mg半纤维素酶)。2、制备多年生黑麦草上表皮细胞切片：取多年生黑麦草叶片投入FPA固定液中，固定24小时后，取出进行徒手切片的制作。用蒸馏水冲洗数次以清除叶片表面的固定液。用刀片轻轻刮去叶片背面部分叶表皮及部分叶肉后，投入步骤1所得的混合酶液(1/3果胶酶+1/3纤维素酶+1/3半纤维素酶)中，在27℃水浴环境中解离2h后取出。将解离后的叶片组织段浸入盛有蒸馏水的培养皿中进行清洗，去除混合酶液。将叶片组织段平铺于载玻片上，轻轻刮去叶片背面残存的叶肉及其他组织，反复进行此过程，直至叶片表皮呈现透明状，即得多年生黑麦草上表皮细胞切片。实验例1将实施例1制备的多年生黑麦草表皮细胞切片置于10×20倍的奥林巴斯显微镜下观察，结果如图1所示。由图1可见，其中的表皮毛、叶片气孔、叶片表皮细胞、运动细胞清晰可见。对比例1本对比例用于探讨相同酶解时间条件下，相同浓度不同酶液对同等操作下制备切片的影响。试验组1：同实施例1；试验组2：与实施例1的区别在于1％混合酶液由1/2果胶酶和1/2纤维素酶组成；试验组3：与实施例1的区别在于1％混合酶液由1/3果胶酶和2/3纤维素酶组成；试验组4：与实施例1的区别在于1％混合酶液由2/3果胶酶和1/3纤维素酶组成。在显微镜下观察试验组1～4制备得到的切片，结果分别如图1～4所示，由图可知，当混合酶液由纤维素酶、果胶酶和半纤维素酶组成时，切片中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多年生黑麦草表皮细胞切片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选取多年生黑麦草叶片，投入FPA固定液中固定至少24小时，取出进行徒手切片，获得待观察多年生黑麦草叶片；(2)冲洗叶片表面残留的固定液，刮去叶片一侧表皮及部分叶肉后，投入浓度为0.9～1.1％的混合酶液中，在26～28℃条件下解离1～3h后，清洗去除混合酶液；(3)刮去残存组织，直至叶片表皮呈现透明状，即得多年生黑麦草表皮细胞切片；其中，所述混合酶液中含有等质量比的果胶酶、纤维素酶和半纤维素酶。

【技术特征摘要】
1.一种多年生黑麦草表皮细胞切片的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选取多年生黑麦草叶片，投入FPA固定液中固定至少24小时，取出进行徒手切片，获得待观察多年生黑麦草叶片；(2)冲洗叶片表面残留的固定液，刮去叶片一侧表皮及部分叶肉后，投入浓度为0.9～1.1％的混合酶液中，在26～28℃条件下解离1～3h后，清洗去除混合酶液；(3)刮去残存组织，直至叶片表皮呈现透明状，即得多年生黑麦草表皮细胞切片；其中，所述混合酶液中含有等质量比的果胶酶、纤维素酶和半纤...

【专利技术属性】
技术研发人员：常智慧，孙碧徽，尹淑霞，韩烈保，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11