工程化机械功能性人类软骨和其制备方法技术

本发明专利技术公开了具有来自成人间充质干细胞的工程化机械功能性软骨的医疗装置和其制备方法。

Engineered mechanical functional human cartilage and process for the preparation thereof

A medical device having an engineered mechanical functional cartilage derived from adult mesenchymal stem cells and a process for its preparation are disclosed.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】工程化机械功能性人类软骨和其制备方法关于联邦政府赞助研究的声明本专利技术是在由国家卫生研究院授予的授权号为DE016525和EB002520的政府支持下完成。政府具有本专利技术中的某些权利。
本公开涉及组织工程化领域，并且更具体地涉及组织工程化机械功能性人类软骨。
技术介绍
随着世界人口老龄化，多年来膝盖和髋关节置换术估计增加多倍。此外，肌肉骨骼损伤(例如运动损伤)正在增加，在过去十年中，儿科人群增加了一倍以上。在体外由患者的细胞产生功能性组织将通过提供由于损伤、疾病或老化而损失或损坏的组织的生物替代物而彻底改革再生医学。对胚胎发育和干细胞生物学的日益增长的理解极大地影响了支架设计、细胞操作以及调节干细胞分化和组织形成的因子(生物化学和物理)的合并的组织工程改造方法。组织工程改造是软骨再生特别感兴趣的，因为软骨因其无血管性仅展现出极小的内源性愈合能力。软骨疾病的标志特征包括机械特性的损失、胶原蛋白降解、蛋白多糖合成减少以及细胞性降低。修复局灶性软骨病变的方法包括激光焊料焊接、经由骨膜移植物进行的自体移植细胞/组织转移、镶嵌式成形术以及用于软骨再生的自体软骨细胞植入法。虽然这些选择可暂时缓解症状，但它们也会带来长期的问题。在软骨组织工程改造中，已将支架材料与原代牛软骨细胞一起用于工程改造具有接近于天然组织的特性的软骨。然而，当与人类间充质干细胞(hMSC)一起使用时，这些方法产生了非正常软骨组织，人类间充质干细胞是临床应用的优选细胞来源。工程改造组织(或甚至器官)的生物替代物变得越来越可信，但仍然面临重大障碍。软骨为组织工程师的主要关注点，因为它是仅含有一种细胞类型的无血管组织，并且最初被认为是一个容易的目标。举例来说，由从患者的膝盖收获并且在培养物中扩增的自体软骨细胞进行的软骨修复提供了细胞治疗产品。然而，从患者的膝盖收获自体软骨细胞与关节炎的发病和风险相关。不同的细胞来源(诸如骨髓或脂肪hMSC)将引起很高的临床兴趣，因为它将避免从膝盖收获组织。此外，已使用自体和同种异体hMSC作为营养因子的来源，以在临床试验中诱导软骨再生。这些方法中没有一个能产生机械功能性人类软骨。迄今为止，由hMSC产生的软骨的组成和机械特性仍然低于由软骨细胞实现的组成和机械特性。因此，仍然需要机械功能性软骨组织的有效组织工程改造。
技术实现思路
在第一方面，提供一种包括具机械功能性的工程化人类软骨的医疗装置。工程化软骨展现出天然人类软骨的特性。举例来说，但不限于，工程化软骨具有>800kPa的杨氏模量(Young’smodule)和<0.3的平衡摩擦系数。在其他实施方案中，工程化人类软骨具有生理分层特性、刚度或摩擦学特性。在一个实施方案中，将工程化人类软骨附着至骨基底。在此方面，医疗装置为植入物。在一些实施方案中，工程化人类软骨为解剖学形状的，并且可用于置换或修复骨骼。在此方面，医疗装置和/或工程化软骨可为临床尺寸的，例如厘米尺寸。骨基底可为髁突的关节表面。可例如通过使患者的髁突成像并采用例如3D打印技术将髁突配置成对应于患者的解剖学人类髁突。因此，医疗装置可为针对特定患者的个性化骨软骨组织构建体。在另一个实施方案中，可将工程化软骨用于诸如注射笔等递送装置中，用于局部递送至骨缺损处。在另一方面，主题涉及解剖学支架。支架包括脱细胞骨基质；和凝集间充质体。在一个实施方案中，凝集间充质体形成设置于骨基底上的致密细胞层。凝集间充质体的致密细胞层和骨基底形成分层结构。在一些实施方案中，脱细胞骨基质为多孔的，并且凝集间充质体分散在多孔基质中。换句话说，凝集间充质体渗入多孔骨以形成构建体。在另一方面，提供一种产生骨软骨构建体的方法。该方法包括培养人类间充质干细胞以形成凝集间充质体，然后使凝集间充质体融合或附着于骨基底上。附图说明参考附图提供对本文所描述的主题的各个方面、特征以及实施方案的详细描述，以下简要描述附图。图式为说明性的，并且未定按比例绘制，为清楚起见，将一些组件和特征放大。图式说明本主题的各个方面和特征，并且可整体或部分地说明本主题的一个或多个实施方案或实施例。图1展示所公开主题的一个实施方案，其中第3天示出了由1×105至2×106个hMSC形成的CMB(比例尺：1mm)。在此实施方案中，(1-5)×105范围内的细胞数目使得形成凝集球形CMB，而更高的细胞数目产生扁平的CMB。图2展示一个实施方案，其中对凝集细胞体中的DNA含量进行定量并且标准化为初始接种DNA含量，表明聚集效率随细胞数目增加而降低。图3为根据本公开的一个示例性实施方案的CMB的凝集和整合的示意性说明。图4展示根据本公开的一些示例性实施方案CMB在三色染液(Trichrome)和染色的腱生蛋白(边界确定的指示)中1、3、5、7以及9天时的切向细胞衬里(比例尺：100μm)。图5展示根据本公开的实施方案通过TNC和SDC3基因的高表达以及增加的HOXA2和CDH2基因表达对CMB的边界的表征。软骨形成因子SOX9随着CMB变得更加成熟而逐渐增加。纤连蛋白表达FN保持恒定。图6展示根据本公开的实施方案CMB在不同发育阶段的融合(比例尺：200(μm)。在融合后7-9天时，与早期CMB(第1-5天)相比，所有CMB在周边显示腱生蛋白沉积(上排)。融合的早期CMB中的软骨形成产生均匀的糖胺聚糖结构(下排)，而在融合的后期CMB中清楚地看到相邻CMB之间的边界(箭头)。图7展示根据本公开的实施方案在骨基底上形成关节软骨的方法，其中将CMB放入PDMS环中，插入骨支架并且压至CMB上以使CMB融合并渗入支架孔隙内部，从而产生复合骨软骨构建体。在分化之后，细胞层形成软骨并且与多孔支架整合。图8展示根据本公开的实施方案在融合后第1天和第5周的CMB和骨软骨构建体，其中生物工程化软骨和软骨下骨的组织学和免疫组织化学切片指示适当的基质组成和软骨形成。图9展示关节软骨插入物的俯视图和侧视图，其中根据本公开的实施方案融合的CMB发育成覆盖整个构建体表面的厚软骨层。图10说明了根据本公开的实施方案在5周的软骨形成诱导之后由第3天、第5天以及第7天的CMB形成的软骨层的DNA、糖胺聚糖(GAG)以及羟脯氨酸(HYP)的含量。软骨下区域具有类似的GAG和HYP含量，而第7天的CMB的DNA含量显著较低，表明迁移和整合能力降低。图11说明了根据本公开的实施方案的CMB融合的方法，其中将CMB放置于呈确切髁突形状的模具的软骨侧，将解剖学形状的多孔支架放置于另一侧，并且将两片式模具压合。CMB融合在一起，并且沿着关节表面以厚细胞层的形式粘附于支架。图12展示根据本公开的实施方案在5周的培养之后在下面骨骼上的关节软骨的解剖层。图13展示对根据本公开的实施方案进行过H&E染色的软骨基质的组织学和免疫组织化学分析(比例尺：低倍率图像中为500μm，而高倍率图像中为50μm)。图14展示对根据本公开的实施方案针对GAG进行过阿尔新蓝(Alcianblue)染色的软骨基质的组织学和免疫组织化学分析(比例尺：低倍率图像中为500μm，而高倍率图像中为50μm)。图15展示对根据本公开的实施方案针对抗II型胶原蛋白进行过染色的软骨基质的组织学和免疫组织化学分析(比例尺：低倍率图像中为5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种医疗装置，其包括：工程化人类软骨，其中所述工程化人类软骨具有大于约800kPa的杨氏模量和小于约0.3的平衡摩擦系数。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.01.23 US 62/107,256;2015.08.21 US 62/208,1471.一种医疗装置，其包括：工程化人类软骨，其中所述工程化人类软骨具有大于约800kPa的杨氏模量和小于约0.3的平衡摩擦系数。2.如权利要求1所述的医疗装置，其中将所述工程化人类软骨附着至骨基底。3.如权利要求1所述的医疗装置，其中所述工程化人类软骨为解剖学形状的。4.如权利要求1所述的医疗装置，其中所述工程化人类软骨为厘米尺寸的。5.如权利要求1所述的医疗装置，其中所述工程化人类软骨包括生理分层特性。6.如权利要求1所述的医疗装置，其中所述工程化人类软骨具有刚度和摩擦学特性。7.如权利要求1所述的医疗装置，其中将所述工程化人类软骨设置于递送装置中。8.如权利要求7所述的医疗装置，其中所述递送装置为注射笔。9.如权利要求2所述的医疗装置，其中所述骨基底为髁突的关节表面。10.如权利要求9所述的医疗装置，其中所述髁突对应于患者的解剖学人类髁突，并且所述医疗装置为针对所述患者的个性化骨软骨组织构建体。11.一种解剖学支架，其包括：骨样基质；和凝集间充质体。12.如权利要求11所述的支架，其中所述凝集间充质体形成设置于所述骨样基质上的致密细胞层。13.如权利要求12所...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·普密拉塔纳，G·武尼亚克诺瓦科维奇，
申请(专利权)人：纽约市哥伦比亚大学理事会，
类型：发明
国别省市：美国,US