一种避免微藻光抑制以提高虾青素产量的方法技术

本发明专利技术涉及一种微藻培养过程中避免光抑制以提高虾青素产量的新方法。培养微藻产虾青素通常采用两阶段法，第一阶段通过异养、自养或者混养方式实现细胞的大量繁殖及生物量的累积，第二阶段通过光胁迫并辅以营养胁迫等方法实现胞内虾青素的累积。但是由第一阶段转第二阶段往往会出现光抑制等现象，严重影响虾青素的产量。因此本发明专利技术通过对转化过程中培养条件的控制，如：控制培养基组成、遮阳、弱光过渡、提高初始接种密度、逐步稀释、调整户外接种时间等手段，调节细胞状态，使细胞增强抵抗强光的能力，因此充分克服了微藻强光下的光抑制问题，可极大地提高微藻生产虾青素的效率，实现低成本、高效率及大规模培养微藻生产虾青素。

Method for avoiding photoinhibition of microalgae so as to increase astaxanthin production

The invention relates to a new method for avoiding photoinhibition in culturing microalgae to increase astaxanthin production. Microalgae astaxanthin production usually adopts two stage method, cumulative mass propagation and biomass of the first phase of cells by heterotrophic, autotrophic or polyculture mode, the second stage through the accumulation of light stress with nutrition stress and other methods to achieve intracellular astaxanthin. However, from the first stage to the second stage, photoinhibition often occurs, which seriously affects the yield of astaxanthin. Therefore the control of culture conditions in the process of transformation, such as: control of medium composition, sun shading, weak light transition and improve the initial inoculation density, gradually dilute and adjust outdoor inoculation time and other means to regulate the cell cell state, enhance the ability to resist light, thus fully overcome the problem under the glare of photoinhibition of microalgae, can greatly improve the efficiency of astaxanthin production of microalgae, low cost, high efficiency and large scale cultivation of microalgae to produce astaxanthin.

【技术实现步骤摘要】
一种避免微藻光抑制以提高虾青素产量的方法
本专利技术属于微藻生物
，具体涉及一种调节微藻细胞状态提高虾青素产量的方法。
技术介绍
虾青素(Astaxanthin)，化学名称为3,3’-二羟基-4,4’-二酮基-β,β’-胡萝卜素，分子式为C40H52O4，相对分子质量为596.86，又名虾黄质、虾黄素或龙虾壳色素，是一种酮式类胡萝卜素。色泽为粉红色，具脂溶性，不溶于水，易溶于氯仿、丙酮、苯和二硫化碳等有机溶剂。虾青素的化学结构是由4个异戊二烯单位以共轭双键型式连结，两端又有2个异戊烯单位组成六节环结构。由于虾青素的化学结构中含有一个长的共轭不饱和双键系统，因此，它很容易受光、热、氧化物等的作用而破坏其结构。虾青素的化学结构见下式：虾青素是类胡萝卜素的一种，也是类胡萝素合成的最高级别产物，β-胡萝卜素、叶黄素、角黄素、番茄红素等都是类胡萝卜素合成的中间产物。因此，在自然界中，虾青素具有最强的抗氧化性。天然虾青素是迄今为止人类发现自然界中最强的抗氧化剂，其抗氧化活性远远超过现有的抗氧化剂，被誉为“超级氧化剂”。虾青素具有广泛的应用价值，不仅可以用作水产养殖的饲料添加剂和人类食品添加剂，在药品、化妆品和营养保健品等领域也具有很大的应用潜力。相比较而言，利用微藻生产虾青素具有明显的优势。其中，雨生红球藻含有约占细胞干重1-5％的虾青素，是自然界中虾青素含量最高的天然物种。首先，虾青素在微藻中主要是以单酯的形式存在，其结构为反式结构，较化学合成的顺式结构生物利用度高；其次，微藻的生长周期短、生产设备占地面积小，产品质量和产量相对稳定；最后，微藻(如雨生红球藻等)本身就是一种高价值的产品，含有大量的蛋白质、油脂、多糖等活性成分，可以分离提取这些物质，实现微藻细胞的综合利用。目前，根据微藻生产虾青素的过程，以雨生红球藻为例，一般将微藻培养过程分为微藻培养和虾青素积累两个阶段。第一阶段(微藻培养)主要进行雨生红球藻的培养，使其快速生长，该阶段可以是光自养、异养和混养。第二阶段(虾青素积累)是通过诸如高光照、高温、高盐、营养盐饥饿等一系列胁迫手段，促使雨生红球藻在恶劣的生存环境下转变为厚壁孢子，以达到积累虾青素的目的。在这两个阶段中，微藻所需的营养及环境条件不同，目前国内外研究主要集中在这两个阶段的条件选择和控制以及环境因子的影响等方面。通常情况下，第一阶段并不以积累虾青素为目的，而是在于增加细胞数目及重量，此时通过采用比较缓和的培养条件，如：弱光、低盐；而后转入第二阶段，此时辅以强光、高温、高盐等胁迫条件且添加氮磷缺乏的培养基，促进虾青素的积累，此阶段细胞数目不再增加，有时随着胁迫条件的恶劣程度增加，细胞数目下降，但由于细胞孢子化及膨大，细胞重量缓慢增加，胁迫培养结束与开始时相比，单位体积培养液中的细胞重量增加2～4倍，达到约2～3g/L。虾青素积累阶段培养基和微藻培养阶段的培养基不完全相同，后者N、P丰富且要求各元素间配比合理(必需碳、氮、磷、硫，钠、钙、钾、镁等元素)，前者仅需添加钙盐等少数盐类物质且一般缺乏氮、磷。然而，从前一阶段(微藻培养)转到第二阶段(虾青素积累)存在一个主要问题，即：细胞已经适应第一阶段的缓和环境，转到第二阶段时，环境改变以及苛刻的胁迫条件，易造成细胞难以适应，发生死亡、损伤等情况。例如：细胞在第一阶段培养时，细胞已经适应弱光环境，转到第二阶段时，光合系统暴露在强光下，极易受到破坏，导致细胞死亡、光抑制等不利于虾青素积累的现象。尽管本领域已经有不少关于这种方法的改进，但是通过对国内外已申请的相关专利分析表明，这些专利大都集中于培养的光生物反应器及装置、雨生红球藻培养基、虾青素的提取新方法等。然而，雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)、小球藻(Chlorellazofingiensis)等可以产虾青素微藻在培养和胁迫之间的过渡工艺方面的专利尚未检索到。因此，针对这一情况，本领域中急需研发新的培养方法，以克服这个缺陷，提高虾青素产量。专利技术简述针对上述问题，本申请提供了一种有效的解决方法。为克服二阶段培养过程从细胞生长条件转换虾青素积累条件时不利于虾青素生产的缺陷，本专利技术设计了一种调节雨生红球藻细胞状态提高虾青素产量的方法，该方法有三种方式：(1)将培养获得的高密度细胞直接强光诱导，然后再转到正常的第二阶段诱导；(2)将培养获得的高密度细胞稀释后进行弱光诱导，然后再转到正常的第二阶段诱导；(3)将培养获得的高密度细胞转到正常的第二阶段诱导，但通过遮光的方式(包括用透明材料或不透明材料遮光)以及优化接种的时间(即在一天内光强较弱的时间点进行接种)使细胞适应胁迫环境，再取消遮光。本专利技术的方法具有如下优势：(1)提高了藻细胞的虾青素产量；(2)手段多样，可根据实际情况，选择最便利的方式；(3)过渡工艺可以直接利用第一阶段或第二阶段诱导的反应器，不需要额外增加设备。根据本申请的一个方面，本申请提供了一种微藻培养过程中避免光抑制以提高虾青素产量的新方法，所述方法包括通过异养、光自养或混养培养方法获得微藻细胞；调整微藻细胞状态；和将调整细胞状态后的微藻细胞进行光诱导或光自养培养以积累虾青素。根据本申请的某些实施方式，所述调整微藻细胞状态是通过控制培养条件来实现。根据本申请的某些实施方式，所述调整微藻细胞状态是将培养获得的高密度细胞直接强光诱导，然后再转到正常的第二阶段诱导；将培养获得的高密度细胞稀释后进行弱光诱导，然后再转到正常的第二阶段诱导；或者将培养获得的高密度细胞转到正常的第二阶段诱导，但通过遮光的方式以及优化接种的时间使细胞适应胁迫环境，再取消遮光，其中所述遮光的方式包括用透明材料或不透明材料遮光；以及所述优化接种的时间是指在一天内光强较弱的时间点进行接种，其中高密度细胞是指细胞密度为0.5-5g/L，光强较弱是指光强低于10klux。根据本申请的某些实施方式，所述控制培养条件包括：调整微藻细胞的培养基，控制培养基的pH在4-10之间，碳源浓度(选自醋酸钠等)为0-60mM、氮源浓度(选自硝酸钠等)为0-100mM和/或磷浓度(选自甘油磷酸二钠等)为0-10mM，并控制温度为5～50℃；对微藻细胞进行光照：光照强度可随调整过程逐渐加大，范围在0～200klx之间，优选所述光照为连续或间歇光照，优选所述光照的光源可以为自然光或人工光，光质可为红光、蓝光、黄光或白光；控制光强的方式：使用人工光源时，改变人工光源的灯光强度；使用日光时，可以通过幕帘、遮阳布、塑料薄膜来遮挡反应器；调控细胞的密度，例如使得细胞密度在0.1g/L-10g/L之间；或优化接种时间，例如在晴天控制接种时间在下午3点到晚上12点之间。根据本申请的某些实施方式，所述调整微藻细胞状态的培养时间为0.1～300小时，优选所述微藻状态调整结束时，控制培养基中的碳、氮和/或磷等营养成分的浓度较低甚至为零，即小于10mM。根据本申请的某些实施方式，所述的微藻选自可以合成虾青素的微藻，例如雨生红球藻(Haematococcuspluvialis)、小球藻(Chlorellazofingiensis)。根据本申请的某些实施方式，所述调整微藻细胞状态包括：调整细胞的大小：例如每个细胞从0.1ng到50ng之间本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微藻培养过程中避免光抑制以提高虾青素产量的新方法，其特征在于，所述方法包括：通过异养、光自养或混养培养方法获得微藻细胞；调整微藻细胞状态；和将调整细胞状态后的微藻细胞进行光诱导或光自养培养以积累虾青素。

【技术特征摘要】
1.一种微藻培养过程中避免光抑制以提高虾青素产量的新方法，其特征在于，所述方法包括：通过异养、光自养或混养培养方法获得微藻细胞；调整微藻细胞状态；和将调整细胞状态后的微藻细胞进行光诱导或光自养培养以积累虾青素。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调整微藻细胞状态是通过控制培养条件来实现。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述调整微藻细胞状态是将培养获得的高密度细胞直接强光诱导，然后再转到正常的第二阶段诱导；将培养获得的高密度细胞稀释后进行弱光诱导，然后再转到正常的第二阶段诱导；或者将培养获得的高密度细胞转到正常的第二阶段诱导，但通过遮光的方式以及优化接种的时间使细胞适应胁迫环境，再取消遮光，其中所述遮光的方式包括用透明材料或不透明材料遮光；所述优化接种的时间是指在一天内光强较弱的时间点进行接种，其中高密度细胞是指细胞密度为0.3-5g/L，光强较弱是指光强低于10klux。4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述控制培养条件包括：调整微藻细胞的培养基，控制培养基的pH在4-10之间，碳源浓度(选自醋酸钠等)为0-60mM、氮源浓度(选自硝酸钠等)为0-100mM和/或磷浓度(选自甘油磷酸二钠等)为0-10mM，并控制温度为5～50℃；对微藻细胞进行光照：光照强度可随调整过程逐渐加大，范围在0～200klx之间，优选所述光照为连续或间歇光照，优选所述光照的光源可以为自然光或人工光，光质可为红光、蓝光、黄光或白光；控制光强的方式：使用人工光源时，改变人工光源的灯光强度；使用日光时，可以通过幕帘、遮阳布、塑料薄膜来遮挡反应器；调控细胞的密度，例如使得细胞密度在0.1g/L-10g/L之间；或优化接种时间，例如在晴天控制接种时间在下午3点到晚上12点之间。5.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述调整微藻细胞状态的培养时间为0.1～300小时，优选所述微藻状态调整结束时，控制培养基中的碳、氮和/或磷等营...

【专利技术属性】
技术研发人员：李元广，万民熙，章真，黄建科，樊飞，王军，
申请(专利权)人：云南香格里拉泽元藻业健康科技有限公司，嘉兴泽元生物制品有限责任公司，
类型：发明
国别省市：云南,53