The present invention provides a multiple PCR amplification method, which is composed of a pair of 5 'end with the same primers of the same sequence of multiple primers (low concentration) and a pair of universal primers (high concentration) were amplified in the same reaction of PCR, was used in the DNA polymerase is chain replacement thermostable polymerase. A multiple primer sequence contains two parts, i.e., the 3 'end is complementary to the target gene, and the 5' end carries at least 1 sequences identical to the universal primers. The number of \universal primers\ on the top and bottom multiple primers 5 is identical or different, and the sequence of the upper and lower universal primers can be the same or different. In the method, a plurality of amplification products are generated at the same time, and each expansion product contains at least one upstream and a downstream universal primer sequence in addition to a target amplification sequence. The present invention for a cycle can produce amplification products of more than two times, so it can significantly improve the amplification efficiency and detection sensitivity of PCR, suitable as a routine laboratory of molecular biology and medicine means of nucleic acid detection means for detecting low number of template gene.
【技术实现步骤摘要】
一种多倍PCR扩增方法
本专利技术涉及分子生物学
,特别是涉及一种多倍PCR扩增方法。
技术介绍
PCR技术作为一种体外快速扩增特定基因的方法,因其高特异性和灵敏度等优点已广泛应用于各领域。PCR方法的关键是根据目标基因设计一对具有高严谨性的寡核苷酸引物,通过DNA聚合酶酶促反应实现快速扩增。自PCR技术专利技术以来,虽然各种改进和衍生的方法层出不穷,但是都未能突破其基本模式,即每一个目标基因的扩增都是通过与模板互补的一对上下游引物进行的。常规PCR使用一对引物进行扩增,每次循环最多只能产生两倍的扩增产物,故其扩增效率受到限制。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供了一种多倍PCR扩增方法,以突破现有技术中每次循环最多只能产生两倍扩增产物的极限,从而提高PCR的扩增效率及缩短PCR反应时间。本专利技术的多倍PCR扩增方法,所述方法包括在反应混合物中进行所述扩增,所述反应混合物包含一对多倍引物和一对通用引物,且以链替换作用的耐热DNA聚合酶代替常规的DNA聚合酶。以较低浓度的多倍引物在最初的几个循环中引发PCR,产生包含通用引物序列的第一扩增产物;以第一扩增产物为模板,在具有链替换作用的耐热DNA聚合酶作用下,使用较高浓度的通用引物扩增PCR。对于目标基因,一次循环可以产生超过两倍的扩增产物,从而提高PCR的扩增效率以及缩短PCR扩增时间。本专利技术的第一个方面是提供一种多倍PCR扩增方法,包括利用一对3’端与目标基因互补的特异性序列及5’由多个通用序列所构成的多倍引物完成第一轮扩增,产生包含通用引物序列的第一扩增产物;以第一扩增的产物为模板,在具有链替换 ...
【技术保护点】
一种多倍PCR扩增方法,其特征在于:所述方法包括在反应混合物中进行所述扩增,所述反应混合物包含一对多倍引物和一对通用引物,以及具有链替换作用的耐热DNA聚合酶;以较低浓度的多倍引物在最初几个循环引发PCR,产生的第一扩增产物包含多个通用引物序列;以第一扩增产物为模板,使用较高浓度的通用引物扩增PCR,产生包含目标基因的多个第二扩增产物。
【技术特征摘要】
1.一种多倍PCR扩增方法,其特征在于:所述方法包括在反应混合物中进行所述扩增,所述反应混合物包含一对多倍引物和一对通用引物,以及具有链替换作用的耐热DNA聚合酶;以较低浓度的多倍引物在最初几个循环引发PCR,产生的第一扩增产物包含多个通用引物序列;以第一扩增产物为模板,使用较高浓度的通用引物扩增PCR,产生包含目标基因的多个第二扩增产物。2.根据权利要求1所述的多倍PCR扩增方法,其特征在于:所述方法进一步包括步骤:1)第一扩增反应,多倍引物与模板杂交,产生包含至少两个上游通用引物和一个下游通用引物或至少一个上游通用引物和两个下游通用引物序列的第一扩增产物。2)第二扩增反应,以第一扩增产物为模板,通用引物与第一扩增产物结合,在具有链替换作用的耐热DNA聚合酶作用下,产生多个包含目标基因序列和至少一个上游通用引物和一个下游通用引物的第二扩增产物。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于:步骤1)中,多倍引物浓度为5-100nM;所述多倍引物的3’端与目标基因特...
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。