一种基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法技术

本发明专利技术公开了一种基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法，包括以下步骤：选取鸭胚的卵巢组织，将卵巢组织置于灭菌PBS中，将卵巢组织剪碎；在剪碎的卵巢组织碎片中加入混合酶消化液，将卵巢组织碎片和混合酶消化液置于细口消化瓶中，并放置在摇床上进行消化处理；用移液枪吹打卵巢组织碎片，加入胎牛血清终止消化，用细胞筛网过滤；收集滤液，并进行离心处理；弃滤液，在沉淀的细胞中加细胞培养基，用移液器轻柔吹打，使细胞悬浮，将细胞悬浮液铺板培养皿；分离提取得到基于鸭胚的卵母细胞。本发明专利技术不需要解剖成年家禽，减少细胞污染并且减少了试验成本，能够快速高效的获取卵母细胞。

【技术实现步骤摘要】
一种基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法
本专利技术属于家禽育种
，具体地说，涉及一种基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法。
技术介绍
目前，在家畜中卵母细胞体外成熟是一项繁殖生物技术，通过体外成熟培养卵巢有腔卵泡来源的卵母细胞可以为育种、克隆及转基因动物提供丰富的卵源，并且该技术已经在生产上被广泛应用。在此技术中最重要的就是分离出大量并且活性好的卵母细胞，在此方面家畜研究已经非常成熟，然而家禽却鲜有报道。现研究报道中，家畜卵母细胞体外培养是采用胶原酶消化法从腔前卵泡获得到大量来源于0.2-0.3mm腔前卵泡的卵母细胞-颗粒细胞复合物。但是该方法提取并非单一的卵母细胞，影响后续研究，并且对于卵泡结构与哺乳动物不一样的家禽来说该方法是不适合的，因为家禽卵泡体积不仅比家畜小并且卵泡中还有大量的卵黄，影响卵母细胞提取。现有的方法一般选取成年家畜分离提取卵母细胞，这样耗时长。为了全面了解蛋鸭卵母细胞成熟期间的生理过程，本专利技术提供了一种低成本，省时，高效的蛋鸭卵母细胞分离提取方法。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法，包括以下步骤：步骤1、选取鸭胚的卵巢组织4-6个，将卵巢组织置于灭菌PBS中，将卵巢组织剪碎；步骤2、在剪碎的卵巢组织碎片中加入10ml混合酶消化液，将卵巢组织碎片和混合酶消化液置于细口消化瓶中，并放置在摇床上进行消化处理；步骤3、用移液枪吹打卵巢组织碎片，加入胎牛血清终止消化，用细胞筛网过滤；步骤4、收集滤液，并进行离心处理；弃滤液，在沉淀的细胞中加细胞培养基，移液器轻柔吹打20-30次，使细胞悬浮，将细胞悬浮液铺板培养皿；分离提取得到基于鸭胚的卵母细胞。进一步地，步骤1中的鸭胚的胚龄为24-26天。进一步地，步骤2中的混合酶消化液的配比为每10ml中含有3-5mg胶原蛋白酶Ⅱ、3-5mg蛋白酶和3-5mg透明质酸酶。进一步地，步骤2中的消化时间为45-60min，消化温度为37℃，消化转速为170-190r/min。进一步地，步骤3中的胎牛血清的体积浓度为10％，细胞筛网的目数为200目。进一步地，步骤4中的离心转速为1000-1500r/min，离心时间为3-4min。进一步地，步骤4中的细胞悬浮液按照1×104cell/ml浓度铺板培养皿。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)胚胎阶段原始卵泡是整个动物生命周期最多的时期，分离此时期的卵巢能提取大量的卵母细胞；选择此阶段的卵巢还减少了卵黄对提取卵母细胞的影响。2)本专利技术不需要解剖成年家禽，减少细胞污染并且减少了试验成本，能够快速高效的获取卵母细胞。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1是本专利技术实施例3中26胚龄鸭胚卵巢分离提取的卵母细胞混悬液，200倍放大，白色箭头指着的为卵母细胞；图2是本专利技术实施例3中培养1d后卵母细胞悬液，200倍放大，白色箭头指着的为卵母细胞；图3是本专利技术对比例1中性成熟蛋鸭卵巢分离提取的卵母细胞混悬液，200倍放大，白色箭头指着的为卵母细胞，图中椭圆形细胞为鸭血红细胞。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。本专利技术公开了一种基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法，包括以下步骤：步骤1、选取24-26天胚龄的鸭胚的卵巢组织4-6个，将卵巢组织置于灭菌PBS中，用眼科剪将卵巢组织剪碎；选取鸭胚分离卵巢，收集的卵母细胞不仅浓度大，并且都为未成熟阶段的卵母细胞，便于研究蛋鸭卵母细胞成熟机制；步骤2、在剪碎的卵巢组织碎片中加入混合酶消化液(每10ml消化液中含有胶原蛋白酶Ⅱ，蛋白酶，透明质酸酶各3-5mg)，将卵巢组织碎片和混合酶消化液置于细口消化瓶中，于摇床上消化45-60min，37℃，170-190r/min；本专利技术选择胶原蛋白酶Ⅱ，蛋白酶，透明质酸酶这3种酶消化卵巢，因为卵巢结构复杂，卵泡外包覆着结缔组织层，卵母细胞由内到外有颗粒细胞层，卵泡膜层，胶原酶能很好的消化结缔组织，而蛋白酶对上皮组织效果较好，透明质酸酶能降解细胞与细胞之间的蛋白多糖；步骤3、用移液枪吹打卵巢组织碎片，加入体积浓度为10％的胎牛血清终止消化，200目细胞筛网过滤；步骤4、收集滤液，在转速为1000-1500r/min的条件下进行离心处理3-4min；弃滤液，在沉淀的细胞中加细胞培养基，移液器轻柔吹打20-30次，使细胞悬浮；按照1×104cell/ml浓度铺板培养皿；分离提取得到基于鸭胚的卵母细胞；铺板培养皿的细胞浓度高于1×104cell/ml时，细胞悬液中易贴壁细胞之间相互作用，促进增殖分化，贴壁，会影响卵母细胞显微镜下的筛选。实施例1一种基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法，包括以下步骤：步骤1、选取25胚龄的鸭胚的卵巢组织4个，将卵巢组织置于灭菌PBS中，用眼科剪将卵巢组织剪碎；步骤2、在剪碎的卵巢组织碎片中加入混合酶消化液(每10ml消化液中含有胶原蛋白酶Ⅱ，蛋白酶，透明质酸酶各5mg)，将卵巢组织碎片和混合酶消化液置于细口消化瓶中，于摇床上消化45min，37℃，190r/min；步骤3、用移液枪吹打卵巢组织碎片，加入10％胎牛血清终止消化，200目细胞筛网过滤；步骤4、收集滤液，在转速为1200r/min的条件下进行离心处理3.5min；弃滤液，在沉淀的细胞中加细胞培养基，移液器轻柔吹打30次，使细胞悬浮；按照1×104cell/ml浓度铺板培养皿；分离提取得到基于鸭胚的卵母细胞。本实施例1得到比较纯的单一卵母细胞，卵母细胞-颗粒细胞复合物很少，低浓度的细胞铺板阻碍了卵泡膜细胞和颗粒细胞的增殖分化，有利于卵母细胞显微镜下筛选，并且获取的卵母细胞都是未成熟的卵母细胞，便于研究家禽卵母细胞成熟机制。实施例2一种基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法，包括以下步骤：步骤1、选取24天胚龄的鸭胚的卵巢组织6个，将卵巢组织置于灭菌PBS中，用眼科剪将卵巢组织剪碎；步骤2、在剪碎的卵巢组织碎片中加入混合酶消化液(每10ml消化液中含有胶原蛋白酶Ⅱ，蛋白酶，透明质酸酶各4mg)，将卵巢组织碎片和混合酶消化液置于细口消化瓶中，于摇床上消化50min，37℃，170r/min；步骤3、用移液枪吹打卵巢组织碎片，加入10％胎牛血清终止消化，200目细胞筛网过滤；步骤4、收集滤液，在转速为1500r/min的条件下进行离心处理3min；弃滤液，在沉淀的细胞中加细胞培养基，移液器轻柔吹打30次，使细胞悬浮；按照1×104cell/ml浓度铺板培养皿；分离提取得到基于鸭胚的卵母细胞。本实施例2得到比较纯的单一卵母细胞，卵母细胞-颗粒细胞复合物很少，低浓度的细胞铺板阻碍了卵泡膜细胞和颗粒细胞的增殖分化，有利于卵母细胞显微镜下筛选，并且获取的卵母细胞都是未成熟的卵母细胞，便于研究家禽卵母细胞成熟机制。实施例3一种基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、选取鸭胚的卵巢组织4‑6个，将卵巢组织置于灭菌PBS中，将卵巢组织剪碎；步骤2、在剪碎的卵巢组织碎片中加入10ml混合酶消化液，将卵巢组织碎片和混合酶消化液置于细口消化瓶中，并放置在摇床上进行消化处理；步骤3、用移液枪吹打卵巢组织碎片，加入胎牛血清终止消化，用细胞筛网过滤；步骤4、收集滤液，并进行离心处理；弃滤液，在沉淀的细胞中加细胞培养基，移液器轻柔吹打20‑30次，使细胞悬浮，将细胞悬浮液铺板培养皿；分离提取得到基于鸭胚的卵母细胞。

【技术特征摘要】
1.一种基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1、选取鸭胚的卵巢组织4-6个，将卵巢组织置于灭菌PBS中，将卵巢组织剪碎；步骤2、在剪碎的卵巢组织碎片中加入10ml混合酶消化液，将卵巢组织碎片和混合酶消化液置于细口消化瓶中，并放置在摇床上进行消化处理；步骤3、用移液枪吹打卵巢组织碎片，加入胎牛血清终止消化，用细胞筛网过滤；步骤4、收集滤液，并进行离心处理；弃滤液，在沉淀的细胞中加细胞培养基，移液器轻柔吹打20-30次，使细胞悬浮，将细胞悬浮液铺板培养皿；分离提取得到基于鸭胚的卵母细胞。2.根据权利要求1所述的基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法，其特征在于，所述步骤1中的鸭胚的胚龄为24-26天。3.根据权利要求1所述的基于鸭胚的卵母细胞的分离提取方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：罗茜，夏伟光，郑春田，陈伟，何静怡，董春琳，
申请(专利权)人：广东省农业科学院动物科学研究所，
类型：发明
国别省市：广东,44