植物同化铵盐的无机氮同位素分馏值的测定方法技术

本发明专利技术公开一种植物同化铵盐的无机氮同位素分馏值的测定方法。将无性系组培苗分别培养在稳定氮同位素值不同的两种硝酸盐作为唯一氮源的培养基中；待组培苗经过5周培养后，测定上述两种硝酸盐培养下的组培苗叶片的稳定氮同位素值；同样，另取无性系组培苗，将其培养在铵盐分别与两种稳定氮同位素值不同的硝酸盐组成的混合氮源的培养基上；测定两种混合氮源培养下组培苗叶片稳定氮同位素值；计算组培苗利用硝酸盐的份额，据此，再计算出在混合氮源培养下组培苗同化铵盐发生氮同位素分馏后的稳定氮同位素值；最终获取组培苗同化铵盐发生的稳定氮同位素分馏值，也即是待测植物同化铵盐发生的稳定氮同位素分馏值。本发明专利技术可以测定或因在单铵下无法生长的植物或在混合氮源下生长的植物的同化铵盐的无机氮同位素分馏值，因利用同一基因型的无性系组培苗开展培养实验，因此测定的结果更为可靠。

Determination of inorganic nitrogen isotopic fractionation of ammonium salts of plant assimilation

The present invention discloses a method for measuring inorganic nitrogen isotope fractionation value of plant assimilation ammonium salt. The clone seedlings were cultured in medium stable nitrogen isotope values of two kinds of different nitrate as the sole nitrogen source; to plantlets after 5 weeks of training, the two kinds of stable nitrogen isotope determination of nitrate culture under the leaves of tissue culture seedlings of value; similarly, another clone seedlings, cultivation the base will be cultured in ammonium respectively with two kinds of stable nitrogen isotope values of mixed nitrogen source of nitrate in different composition on the determination of two kinds of mixed nitrogen sources; cultivating seedlings under stable nitrogen isotope values calculated by tissue culture plantlets; nitrate share, accordingly, and then calculate the stable nitrogen isotope under cultivation seedling assimilation ammonium nitrogen isotope fractionation occurred after the values in mixed nitrogen source; finally obtain stable nitrogen isotope fractionation seedlings ammonium assimilation of value, that is to be measured nitrogen isotope stable plant ammonium assimilation occurred Fractional value. Inorganic nitrogen isotope fractionation of the invention can be measured or due to growth in single plants under ammonium or in mixed nitrogen source plants grown under the ammonium assimilation value for clone seedlings with the same genotype in culture experiments, so the determination results is more reliable.

【技术实现步骤摘要】
植物同化铵盐的无机氮同位素分馏值的测定方法
本专利技术涉及植物同化铵盐的无机氮同位素分馏值的测定方法，属于作物生产
技术背景氮是植物生长发育过程中的必需元素，是构成蛋白质、核酸、酶、叶绿素等的重要组成成分。大多数植物吸收利用的无机氮主要是硝酸盐和铵盐。植物吸收硝酸盐需要经过还原后才能被植物同化，而铵盐可直接被植物同化。通常每还原1分子硝酸盐需要花费15分子ATP，而同化1分子铵盐仅需5分子ATP。因此，从植物的能量花费角度考虑，植物吸收利用铵盐会比较节省能量。然而大多数植物在铵盐作为单独氮源培养时通常长势不好，生长发育受到抑制。而硝酸盐和铵盐共同存在时，植物生长发育最好。因此，在对植物进行氮管理时，需要合理确定硝酸盐和铵盐的用量。在硝酸盐和铵盐共存下，使植物利用较多的铵盐是比较明智的策略。植物利用铵盐份额与铵盐的供应有关，铵盐供应越多，植物利用铵盐的份额就越大。但是铵盐浓度过高时，虽然植物的铵盐份额很高，但此时就发生铵的无效循环，并最终导致能量的浪费。而硝酸盐和铵盐供应下，植物同化铵盐的能力较强，且利用铵盐份额也就较高，无疑是很优的状态。植物在同化硝酸盐和铵盐时都会发生稳定氮同位素分馏，通常情况下，植物的氮同化能力越强，发生的稳定氮同位素分馏值就越小。因此，可以通过稳定氮同位素分馏值来确定植物的氮同化能力。然而，在野外种植或水培种植植物的硝酸盐和铵盐的氮同化既发生在叶片又发生在根部，因此很难通过测定叶片或根部的稳定氮同位素值来判断植物同化铵盐的能力。稳定氮同位素技术目前已广泛应用到生态学等领域，稳定氮同位素被用作氮源的指示剂来研究生物圈的氮循环。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是：提供一种测定植物同化铵盐的无机氮同位素分馏值的方法，以填补或因在单铵下无法生长的植物或在混合氮源下生长的植物的同化铵盐的无机氮同位素分馏值测定的空白。本专利技术的技术方案：它包含以下步骤：第一，通过植物组织培养技术获得同一基因型的无性系组培苗，通过调节培养基的激素比例使组培苗处于增殖阶段，形成无根的无性系组培苗；第二，通过同位素质谱仪测定用于配置植物组织培养的培养基中的硝酸盐的稳定氮同位素比值，筛选出稳定氮同位素值差值大于10‰的两种硝酸盐，其稳定氮同位素值分别为δ15N01和δ15N02；分别将这两种硝酸盐作为唯一氮源配置培养基；第三，将上述无性系组培苗分别培养在上述稳定氮同位素值不同的两种硝酸盐作为唯一氮源的培养基中；第四，待组培苗经过5周培养后，分别测定上述两种硝酸盐作为唯一氮源的培养基培养下的组培苗叶片的稳定氮同位素值，其叶片稳定氮同位素值分别记为δ15NN1和δ15NN2；第五，选用铵盐配置植物组织培养的培养基，保证其稳定氮同位素值δ15NA与δ15N01或δ15N02的差值均大于10‰；然后将铵盐分别与上述稳定氮同位素值不同的两种硝酸盐组成混合氮源，配置两种不同的混合氮源培养基；第六，同样，另取无性系组培苗，将其分别培养在上述两种不同的混合氮源培养基上；第七，同样，组培苗经过5周培养后，测定上述两种混合氮源培养下组培苗叶片稳定氮同位素值，铵盐与稳定氮同位素值为δ15N01的硝酸盐组成的混合氮源培养下的组培苗叶片稳定氮同位素值记为δ15NN1mix，铵盐与稳定氮同位素值为δ15N02的硝酸盐组成的混合氮源培养下的组培苗叶片稳定氮同位素值记为δ15NN2mix；第八，将δ15NN1、δ15NN2、δ15NN1mix和δ15NN2mix代入方程：即可算出组培苗利用硝酸盐的份额fb，也即待测植物利用硝酸盐的份额；第九，将组培苗利用硝酸盐的份额fb代入方程：或求出在混合氮源培养下组培苗同化铵盐发生氮同位素分馏后的稳定氮同位素值δ15NA-T；第十，依据δ15NA-T和δ15NA求出组培苗同化铵盐发生的稳定氮同位素分馏值Δ15NA，Δ15NA＝δ15NA-δ15NA-T；Δ15NA也即是待测植物同化铵盐发生的稳定氮同位素分馏值。本专利技术优点1)本专利技术可以测定或因在单铵下无法生长的植物或在混合氮源下生长的植物的同化铵盐的无机氮同位素分馏值。2)本专利技术通过双向稳定氮同位素标记培养技术，在测定植物同化铵盐的无机氮分馏值的同时也测定出植物硝酸盐和铵盐的利用份额，根据植物同化铵盐的无机氮同位素分馏值及铵盐利用份额，可以评价不同条件下的铵氮同化能力，以便有效管理植物的氮肥使用，避免氮源的浪费和氮肥过多施用对环境的危害。3)本方法为优质组培苗的培养基筛选提供了技术支持，即选择组培苗铵盐利用份额较高，同时同化铵盐发生稳定氮同位素分馏值较小的培养基。4)本方法利用同一基因型的无性系组培苗开展培养实验，测定的同位素误差小，因此测定的结果更为可靠。5)本方法采用的步骤少，计算简单。在植物组织培养的增殖阶段，可以通过调节细胞分裂素和生长素的浓度比例来确保组培苗在整个增殖阶段不产生根，这样硝酸盐和铵盐的同化就仅发生在叶片。因此，就可通过测定叶片稳定氮同位素值来确定组培苗同化铵盐发生的无机氮同位素分馏值，在结合组培苗铵盐的利用份额，就可为植物的有效氮管理提供指导依据。本专利技术测定组培苗的硝酸盐和铵盐的利用份额是通过双向氮同位素标记培养法。首先用两种稳定氮同位素差值大于10‰的硝酸盐同时培养组培苗，然后，在分别用这两种硝酸盐与同一种铵盐同时培养组培苗，保证铵盐的稳定氮同位素值与这两种硝酸盐的稳定氮同位素值差值均大于10‰。最后就可求得组培苗分别利用硝酸盐和铵盐的份额。知道组培苗利用硝酸盐和铵盐的份额后，也就可确定组培苗同化铵盐发生的稳定氮同位素分馏值。专利技术原理稳定氮同位素技术目前已被广泛用着氮源的指示剂来研究生物圈的氮循环。自然界中氮元素的两种稳定氮同位素为14N和15N，稳定氮同位素值通常用δ15N(‰)表示，自然界中δ15N的变化为-10‰～+20‰。培养在不同氮源下的植物的叶片氮同位素值能很好地反映氮源的稳定氮同位素值的特征。因此，通过质量平衡原理和同位素混合模型就可定量判别植物体内不同的无机氮源。组培苗在同化硝酸盐和铵盐时都会存在一定的氮同位素分馏。在混合氮源条件下培养的组培苗叶片的稳定氮同位素值是同化硝酸盐和铵盐发生氮同位素分馏后的稳定氮同位素值混合的结果。因此，要计算出硝酸盐和铵盐的利用份额，就得准确知道混合氮源培养下组培苗同化硝酸盐和铵盐发生氮同位素分馏后的稳定氮同位素值。由于铵盐作为单独氮源时，有些组培苗不能正常生长，例如十字花科植物的组培苗。因此，选用两种稳定氮同位素值差值大于10‰的硝酸盐作为单独氮源同时培养组培苗。测定组培苗分别在这两种稳定氮同位素值不同的硝酸盐培养下的组培苗叶片稳定氮同位素值。然后，将筛选出的铵盐分别和两种稳定氮同位素值不同的硝酸盐组成混合氮源同时培养组培苗，铵盐的稳定氮同位素值与两种硝酸盐的稳定氮同位素值的差值均大于10‰。分别测定两种混合氮源培养下组培苗叶片的稳定氮同位素值。最后通过两端元混合模型来计算出组培苗分别利用硝酸盐和铵盐的份额。两端元的同位素混合模型表示为：δ15NN1mix＝fbδ15NN1+faδ15NA-T(1)δ15NN2mix＝fbδ15NN2+faδ15NA-T(2)fa＝1-fb(3)这里的δ15NN1和δ15NN2分别为组培苗在稳定氮同位素值差值大于10‰的两种硝酸盐培本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物同化铵盐的无机氮同位素分馏值的测定方法，其特征在于：包含以下步骤：第一，通过植物组织培养技术获得同一基因型的无性系组培苗，通过调节培养基的激素比例使组培苗处于增殖阶段，形成无根的无性系组培苗；第二，通过同位素质谱仪测定用于配置植物组织培养的培养基中的硝酸盐的稳定氮同位素比值，筛选出稳定氮同位素值差值大于10‰的两种硝酸盐，其稳定氮同位素值分别为δ

【技术特征摘要】
1.一种植物同化铵盐的无机氮同位素分馏值的测定方法，其特征在于：包含以下步骤：第一，通过植物组织培养技术获得同一基因型的无性系组培苗，通过调节培养基的激素比例使组培苗处于增殖阶段，形成无根的无性系组培苗；第二，通过同位素质谱仪测定用于配置植物组织培养的培养基中的硝酸盐的稳定氮同位素比值，筛选出稳定氮同位素值差值大于10‰的两种硝酸盐，其稳定氮同位素值分别为δ15N01和δ15N02；分别将这两种硝酸盐作为唯一氮源配置培养基；第三，将上述无性系组培苗分别培养在上述稳定氮同位素值不同的两种硝酸盐作为唯一氮源的培养基中；第四，待组培苗经过5周培养后，分别测定上述两种硝酸盐作为唯一氮源的培养基培养下的组培苗叶片的稳定氮同位素值，其叶片稳定氮同位素值分别记为δ15NN1和δ15NN2；第五，选用铵盐配置植物组织培养的培养基，保证其稳定氮同位素值δ15NA与δ15N01或δ15N02的差值均大于10‰；然后将铵盐分别与上述稳定氮同位素值不同的两种硝酸盐组成混合氮源，配置两种不同的混合氮源培养基；第六，另取无性系组培苗，将其分别培养在上述两种不同的混合氮源培养基上；第七，同样，组培苗经过5周培养后，测定上述两种混合氮源培养下组培苗叶片稳定氮同位素值，铵盐与稳定氮同位素值为δ15N01的硝酸盐组成的混合氮源培养下的组培苗叶片稳定氮同位素值记为δ15NN1mix，铵盐与稳定氮同位素值为δ15N02的硝酸盐组成的混合氮源培养下的组培苗...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴沿友，张开艳，饶森，李环，方蕾，吴沿胜，赵丽华，刘丛强，王世杰，
申请(专利权)人：中国科学院地球化学研究所，
类型：发明
国别省市：贵州,52