一种在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子制造技术

本发明专利技术提供一种在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示，所述启动子在种子发育过程中能够驱动目标基因特异表达，但当种子成熟后至干种子时，驱动活性消失。本发明专利技术还提供了含有该启动子的表达盒和植物表达载体及应用。具体而言，本发明专利技术将上述启动子应用在植物转基因工程中，该启动子可以启动外源基因在植物中表达，适用于任何植物，尤其能够驱动外源基因在水稻植株的种子发育过程中特异表达，因此可以用于培育理想的水稻品种，提高水稻产量和品质。

【技术实现步骤摘要】
一种在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子
本专利技术涉及生物技术和植物基因工程
，特别涉及水稻种子特异性表达启动子及其应用。
技术介绍
在植物界中，能形成种子的植物约占植物总数的三分之二以上。作为重要的繁殖器官，种子同时也为人们提供食物来源，水稻就是其中的重要代表。种子的发育是从受精开始的，通过双受精过程，从花粉管尖端释放出的一个精子与卵细胞融合，形成二倍体的合子，发育成胚；另一个精子与两个极核融合后发育成三陪体的胚乳。这是一个从单细胞的受精卵分裂分化成多细胞个体的过程，其间伴随着特定基因的表达和积累。具体来讲，整个过程可分为早期胚胎发生(水稻等单子叶植物中包括球形胚期、早期器官分化和建成)，种子的成熟(包括胚乳的发育和大量贮藏蛋白的积累)和种子的休眠(此时种子脱水，大部分基因的转录和蛋白质的合成停止)。当种子在适当的温度和水分条件下，种子开始萌发。外部激素、温度和光照等因素影响着种子的发育和萌发过程。在单子叶的禾本科植物中(如水稻、小麦)，随着种子的发育成熟，胚乳的体积不断增大，占据了种子的主要部分，其主要作用是贮存各类贮藏产物。胚乳发育是水稻种子发育中的一个非常重要的过程，这是因为该过程直接为人们提供了粮食来源。胚乳占糙米重量的90％，其发育情况直接决定了种子的重量和稻米的品质。水稻胚乳的主要成分是淀粉，简单的可以认为稻米品质取决于种子中淀粉的合成及积累的过程。随着贮藏产物的大量合成和累积，胚体迅速增大，种子逐渐成熟。在胚发育的后期ABA开始累积。脱落酸(abscisicacid,ABA)是种子脱水和休眠的信号，以防止种子在成熟前的植株上萌发(precociousgermintion)。在胚的成熟和休眠过程中，一些ABA诱导的基因开始转录，并引起大部分其他基因转录的停止，使胚的呼吸和代谢活动降至最低水平。当外部环境温度和水分适宜时，赤霉素(gibberellin,GA)开始增多，种子的代谢活动开始活跃，和萌发相关的基因逐渐表达。赤霉素和脱落酸的相互拮抗有效的控制了种子休眠和萌发的过程。粮食短缺是本世纪最严重的全球性问题之一，近年来随着社会经济的快速发展和农业技术的不断提高，粮食短缺的问题得到缓解，但为了满足由于人口迅速增长而不断扩大的粮食需求，世界粮食总产量到2050年需要增加70％。中国粮食总产量到2033年需要提高35％。水稻作为重要的粮食作物之一，世界人口所需能量的21％，东南亚人口所需能量的76％均来自水稻。因此，提高水稻产量和改善稻米品质，具有重要的战略意义。水稻籽粒发育的好坏直接决定产量的高低和品质的优劣，而籽粒的灌浆充实过程决定了最终的粒重和产量乃至稻米的品质。围绕水稻籽粒灌浆充实差异问题，前人从＂源＂——物质的生产能力、＂流＂——茎銷物质的运转能力、＂库＂容活性——籽粒蔗糖-淀粉代谢关键酶活性、内源激素含量等方面开展了系统研究工作。越来越多的证据显示，库容活性与水稻弱势籽粒的灌浆充实关系密切。从分子生物学的角度来说，种子的发育和萌发是一个有次序的、选择性的基因表达过程。挖掘种子发育相关启动子，不仅有利于对水稻种子发育分子机制的了解，而且为在分子水平上操作水稻等禾谷类作物的种子发育过程，改良禾谷类作物的产量和品质创造条件。水稻抽穗后光合产物主要以可溶性糖的形式运输到胚乳细胞，用于淀粉粒的形成，随着子房的发育，籽粒长、宽、重迅速增加。开花至成熟1个月左右的时间是水稻籽粒发育成熟的主要阶段，此时籽粒的灌浆充实动态直接关系到水稻产量与品质。若是能够仅仅在水稻种子在发育到成熟期间促进种子的发育，而在种子成熟之后，不再对种子的发育施加影响，则既能够促进种子生长，又预留足够的时间给水稻消化转基因所带来的代谢影响以及其他方面负面影响。但是，现有启动子往往都是在植物生长的全周期发挥作用，启动子容易对植物的代谢带来较大的负担，影响植物生长，并且由于启动子作用的长期性，更容易引起人们对转基因作物的担忧。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种驱动外源基因在植物生长的特定时期，尤其是水稻生长的特定时期发挥作用的启动子。水稻种子发育特异性表达的启动子、获得含有该启动子序列的转化子以及该启动子的应用。为了实现上述目的，一方面，本专利技术提供一种在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子，其特征在于，所述水稻种子特异表达启动子包含下述(1)-(4)中任一项所示的序列，(1)SEQIDNo:1所示的序列；(2)与SEQIDNo:1所示的DNA序列有至少80％同源性的序列；(3)在SEQIDNo:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；(4)在严格条件下与(1)、(2)或(3)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA序列。序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列为来源于日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)的水稻种子特异性表达启动子，本文中称为Posendos7或启动子Posendos7。另一方面，本专利技术还提供一种包含上述在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子的表达盒和重组表达载体。再一方面，本专利技术提供上述在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子在培育转基因植物中的应用。所述应用包括将本专利技术提供的上述在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子连接于载体的待表达的基因序列上游(例如，将所述启动子序列置于目标基因之前)，从而构建重组表达载体，将所述重组表达载体转化到植物细胞、组织或器官中进行培育。并且优选地，所述应用可以用于培育理想水稻品种，改良水稻的品质和产量。具体实施中，本专利技术的专利技术人从日本晴水稻(OryzasativaLcv.Nipponbare)中分离克隆得到结构包括转录起始位点上游的1960bp的DNA序列，并将其命名为Posendos7(序列表中的SEQIDNo:1)。将该序列经酶切后连接到植物双元表达载体pCAMBIA1381上，获得相应的重组质粒(即重组表达载体)，用于驱动GUS基因的表达。利用该重组质粒转化根癌农杆菌菌株EHA105，然后用农杆菌介导的方法进行水稻的转化，得到转基因水稻植株。对获得的转基因水稻进行组织化学检测发现，在未成熟的转基因植株的种子中有明显的GUS染色，而在其他组织中没有染色。同时，当水稻籽粒灌浆完成，成为成熟种子后，种子中GUS染色又消失，从而证明该1960bp的序列具有驱动基因在种子发育中表达的活性。此外，由于本专利技术的启动子在种子成熟期活性消失，所以，本申请的专利技术人还提出了一种能够降低转基因影响的水稻培育方法，利用本专利技术所获得的启动子，与具有提高种子淀粉或蛋白质含量的基因相结合，构建重组表达载体，然后将所述重组表达载体转入到水稻细胞中，培育转基因植株，所获得的转基因植株在生长过程中，在启动子的作用下，能够改善种子的发育，但是当种子进入成熟期后，启动子活性消失，进而预留一定时间段使转基因的影响逐渐降低。此外，本专利技术提供一种促进水稻灌浆期种子发育的水稻培育方法，其特征在于，所述方法包括：(1)获取所述的在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子；(2)取成熟水稻种子，进行愈伤诱导培养；(3)构建含有权利要求1中所述的在植物生长的特定时期内本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子，其特征在于，所述水稻种子特异性启动子包含下述(1)‑(4)中任一项所示的序列，(1)SEQ ID No:1所示的序列；(2)与SEQ ID No:1所示的DNA序列有至少80％同源性的序列；(3)在SEQ ID No:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；(4)在严格条件下与(1)、(2)或(3)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA序列。

【技术特征摘要】
1.一种在植物生长的特定时期内表达的水稻种子特异性启动子，其特征在于，所述水稻种子特异性启动子包含下述(1)-(4)中任一项所示的序列，(1)SEQIDNo:1所示的序列；(2)与SEQIDNo:1所示的DNA序列有至少80％同源性的序列；(3)在SEQIDNo:1所示的DNA序列中添加、取代、插入或缺失一个或一个以上核苷酸生成的突变体或等位基因或衍生物；(4)在严格条件下与(1)、(2)或(3)限定的DNA序列杂交，且具有启动子功能的DNA序列。2.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包含权利要求1中所述的水稻种子特异性启动子。3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含权利要求1中所述的水稻种子特异性启动子，在所述重组表达载体中，所述水稻种子特异表达启动子连接于载体中待表达的基因序列的上游。4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述待表达的基因为GUS基因，所述重组表达载体为pCAMBIA1381-Posendos7，其中pCAMBIA1381为植物双元表达载体。5.一种根据权利要求1中所述的水稻种子特异表达启动子在培育转基因植物中的应用，其特征在于，所...

【专利技术属性】
技术研发人员：李娟，杨剑波，杨亚春，李莉，秦瑞英，李浩，许蓉芳，
申请(专利权)人：安徽省农业科学院水稻研究所，
类型：发明
国别省市：安徽,34