一种特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列及应用制造技术

一种特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列及应用，涉及一种sgRNA导向序列及应用。该sgRNA导向序列为CGTCTCGCGCTTGGACTCAG。本发明专利技术提供的sgRNA导向序列可通过CRISPR/Cas9系统敲除或编辑IGFBP3基因，进而消除IGFBP3的表达，为制备IGFBP3转基因猪奠定基础。本发明专利技术应用于基因工程领域。

【技术实现步骤摘要】
一种特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列及应用
本专利技术涉及一种sgRNA导向序列及应用。
技术介绍
CRISPR/cas9基因编辑系统是基于II类CRISPR/Cas系统改造而来的。Cas9蛋白是唯一所需要的，用来介导外源DNA沉默的Cas蛋白。2012年，Jinek通过体外实验证实Cas9蛋白对原间隔序列进行切割不仅仅需要与原间隔序列互补的成熟的crRNA，还需要tracrRNA；通过对切割后的片段测序发现，tracrRNA：crRNA指导Cas9蛋白切割位点是具有位点特异性的，无论是环状质粒还是线性DNA片段，切割位点均在PAM序列上游的3bp处；Cas9蛋白包含HNH及RuvC内切酶结构域，无论对哪个结构域进行突变，均无法有效的进行切割，只是在双链DNA上产生切口，实验证实HNH结构域会对与crRNA互补链进行切割，而RuvC结构域则会对另一条链进行切割；对于众多的CRISPR/Cas系统，识别自我与非我的关键就在于保守的PAM序列，对于II类CRISPR/Cas系统，PAM序列为NGG，当对PAM序列进行突变后，将无法进行有效的切割；此外，还成功的将crRNA与tracrRNA两条链成功的融合成一条大约100nt的单链向导RNA(guideRNA，gRNA)，并能正常发挥crRNA：tracrRNA的功能。这项工作为CRISPR/Cas系统由细菌的天然防御系统向基因编辑工具的转变奠定了基础。2013年1月，麻省理工学院以及哈佛医学院同时再science上首次发表了使用CRISPR/Cas系统对哺乳动物细胞进行基因编辑。在麻省理工学院的研究中，使用酿脓链球菌的II类CRISPR/Cas系统，针对人的Emx1位点设计的crRNA能够高效的在人的293FT细胞基因组的Emx1位点上产生突变。针对该基因的不同PAM序列设计crRNA以及crRNA与tracrRNA嵌合在一起的chiRNA，对细胞进行基因编辑，crRNA均能产生有效的突变，但可能由于RNA的二级结构的影响，并不是所有的chiRNA都能进行高效的位点突变，此外，利用该系统对基因组进行切割后，不仅能够通过非同源性末端接合(NHEJ)的方式进行修复，获得在切割位点附近的碱基缺失或是插入，还可以通过同源重组修复(HDR)的方式，实现特异基因片段的重组，此外，通过针对同一基因的两个位点设计crRNA，可以成功的进行一段片段的基因敲除。使用RuvC结构域突变的Cas9蛋白也能够通过同源重组的修复方式进行修复，但无法获得非同源性末端接合的突变。哈佛医学院也获得了类似的结果，且CRISPR/Cas9系统的基因编辑效率与先前出现的TALEN效率类似，并能够同时针对多个位点进行基因编辑。进一步证实了CRISPR/Cas9系统终将成为真核生物基因编辑领域强大的基因编辑工具。Insulinlikegrowthfactorbindingprotein3(IGFBP3)基因属于生长激素超家族基因。主要作用是与IGF1基因和IGF2结合使IGF1和IGF2基因在体内能正常运输。IGFBP3基因主要表达组织：早期胚胎，内胚层，间充质细胞，消化道系统，心血管系统，淋巴系统，肝胆系统，骨骼肌，神经系统，生殖系统，泌尿系统。IGFBP3基因单敲除后小鼠表行没有变化，IGFBP3基因双敲除后，主要表型为白色脂肪组织减少，体重增加，肝脏重增加，肌肉重量增加。同时，对高糖和高油脂食物出现耐受。这些表型的出现一般认为是IGFBP3基因敲除后，IGFBP2基因出现补偿效应，IGFBP2基因的表达量升高，导致IGF1基因在血液中含量增高，最终导致小鼠体重的增加。同时，基因敲除小鼠的采食量相比于正常小鼠没有发生显著性改变。在猪中研究表明，IGFBP3基因与猪屠体重和背膘厚呈显著相关。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列及其应用，该sgRNA导向序列可以用于敲除猪IGFBP3基因，为制备转基因猪奠定基础。本专利技术特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列为IGFBP3-SgRNA1，其核苷酸序列为：5’-CGTCTCGCGCTTGGACTCAG-3’，如SEQIDNO：1所示，位于基因IGFBP3第二外显子。上述特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列在敲除猪IGFBP3基因中的应用，具体方法如下：一、在猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸；同时根据导向序列获得得其对应的DNA互补链，并且再起5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸；分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成双链；二、将步骤一制得的双链DNA与CRISPR/Cas9载体连接，得到重组敲除表达载体；三、将步骤二制得的重组表达载体连接入药物筛选抗性基因序列；四、将步骤三制得的重组敲除表达载体转染细胞，筛选稳定转染细胞，得到成功敲除IGFBP3基因的细胞。进一步的，步骤二中所述的CRISPR/Cas9载体为pX330载体。进一步的，步骤三中所述的药物筛选抗性基因序列为G418抗性基因序列。进一步的，步骤四中所述转染细胞的方法为脂质体转染法。进一步的，步骤四中所述的细胞为猪成纤维细胞。上述特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列在特异识别和靶向修饰猪IGFBP3基因中的应用。上述特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列在构建猪IGFBP3基因突变库中的应用。特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列，能产生基因插入突变、基因序列置换、基因序列缺失等多种类型IGFBP3基因突变体，可以在构建猪IGFBP3基因突变库中的应用。本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果：本专利技术根据sgRNA导向序列设计合成两条单链核苷酸序列，退火形成双链，然后与Cas9载体连接，利用Cas9载体将sgRNA及CRISPR系统引入目标细胞中，Cas9蛋白会在sgRNA的引导下找到与其匹配的基因组DNA序列，进行剪切，实现猪基因IGFBP3的敲除。(1)利用质粒载体pX330将sgRNA以及CRISPR系统引入细胞中，Cas9蛋白会在sgRNA的引导下找到与其匹配的DNA序列，进行剪切。质粒载体安全性高，不会引起细胞的免疫反应。(2)载体中含有G418抗性基因，利用G418对细胞进行筛选，未转入pX330载体的细胞将在筛选过程中被淘汰。(3)本专利技术提供的特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列，可通过CRISPR/Cas9系统敲除或编辑IGFBP3基因，进而消除IGFBP3的表达，为制备IGFBP3转基因猪奠定基础。附图说明图1是特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列及其位置示意图。图2是PCR扩增猪IGFBP3基因外显子2片段电泳图。具体实施方式下面对本专利技术的实施例做详细说明，以下实施例在以本专利技术技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本专利技术的保护范围不限于下述的实施例。以下实施例中所使用的细胞为原代培养猪成纤维细胞，pX330，pEGFP-C1载体购自Addgene，内切酶BbsI，BsmBI购自NEB，G418和细胞培养基购自Sigma。实施例本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列，其特征在于该序列为IGFBP3‑SgRNA1，IGFBP3‑SgRNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

【技术特征摘要】
1.一种特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列，其特征在于该序列为IGFBP3-SgRNA1，IGFBP3-SgRNA1的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。2.权利要求1所述的特异靶向猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列在敲除猪IGFBP3基因中的应用，具体如下：一、在猪IGFBP3基因的sgRNA导向序列的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸；同时根据导向序列获得得其对应的DNA互补链，并且再起5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸；分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性，退火，形成双链；二、将步骤一制得的双链DNA与CRISPR/Cas9载体连接，得到重组敲除表达载体；三、将步骤二制得的重组表达载体连接入药物筛选抗性基...

【专利技术属性】
技术研发人员：牟彦双，刘忠华，尹智，翁晓刚，
申请(专利权)人：东北农业大学，
类型：发明
国别省市：黑龙江,23