一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法技术

本发明专利技术公开了一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其技术方案要点是步骤为选取外植体，将外植体置于培养基中进行培养，选取外植体后，再将外植体置于培养基内之前，对外植体进行消毒处理；所选取的外植体中，导管尚未发育成熟，为活细胞，能够分裂增殖，其木薄壁组织对外植体的难以起到阻碍分裂的作用。将外植体消毒能够有效去除外植体表面的细菌，减小细菌污染培养基的可能性；同时，不对外植体进行搅碎的操作，能够减少破碎细胞的数量，以便降低细菌污染外植体的可能性，在后期的培养中，细菌的数量少，难以对培养基中的外植体起到污染、损害的作用，以利于外植体正常增殖，提高了实验成功的可能性，利于大批量商业化生产。

Tissue culture and seedling propagation method for Taxus chinensis

The invention discloses a Taxus tissue culture seedling breeding method, the technical proposal is step for selection of explants, the explants were placed in culture medium, selection of explants, before the explants were placed in culture medium, explants were sterilized; explant selection, catheter has not yet mature, as living cells can proliferate, the parenchyma of the explants to hinder the division. The explant disinfection can effectively remove the explant surface bacteria, reduce the possibility of bacterial contamination of culture medium; at the same time, not explants were minced operation, can reduce the number of broken cells, in order to reduce the possibility of bacterial contamination of the explants, in the latter part of the culture, the number of bacteria and less pollution, difficult to the damage of the explants in the medium plays a role, in order to explant normal proliferation, raising the possibility of successful experiments, suitable for large scale commercial production.

【技术实现步骤摘要】
一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法
本专利技术涉及植物培养，特别涉及一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法。
技术介绍
红豆杉为红豆杉科红豆杉属植物。紫杉醇是红豆杉属植物中的一种复杂的次生代谢产物,也是惟一可以促进微管聚合和稳定已聚合微管的药物。但是紫杉醇在红豆杉植物中含量很低，因此市场上对于红豆杉的需求很高。红豆杉植物常规的繁殖方式主要为扦插和播种两种繁殖方式。但红豆杉种子种皮厚，处于深休眠状态，自然状态下经两冬一夏才能萌发，天然更新能力弱，使得播种繁殖的难度较大；同时扦插枝条也由于生根条件苛刻，造成生根率较低，扦插成活率低。因此采用传统的繁殖方式难易满足红豆杉的规模化生产。目前，公开号为CN1454465A的中国专利公开了一种红豆杉种苗组织培养基及其种苗繁育方法，它包括营养剂、生长促进剂、稳定剂、微量元素配制而成。并将红豆杉母体树的嫩扦枝、或嫩枝（芽）叶经机械粉碎后的组织细胞浆加入上述培养基中进行组培。这种培养方法未经消毒，将嫩枝或嫩芽机械粉碎后，部分细胞被搅碎，未经消毒残留的细菌在恒温培养的过程中，以破碎细胞为母体增殖，对培养基造成污染。
技术实现思路
本专利技术的一目的是提供一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其具有减少对培养基的污染的优点。本专利技术的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，步骤为：选取外植体，对外植体进行表面消毒，接种到启动培养基中并给以合适的环境条件进行启动培养，转接到增殖培养基中并给以合适的培养条件进行腋芽增殖培养，对增殖腋芽进行分割并转接到壮苗培养基中给以合适培养条件进行壮苗培养，将经过壮苗培养的无根组培苗接种到生根培养基中并给予合适的培养条件进行生根诱导，所剪取的外植体保留有外植体的高增殖能力；筛选剪取外植体包括如下步骤：S1：选取外植体并对外植体消毒所需的苗木个体为生长年限为3～4年之间的健壮苗木个体，该苗木无病虫害、无机械损伤、无叶片畸形；S2：选取苗木个体于春季自然萌发的嫩梢，所述嫩梢中木质素低于20%，所述嫩梢中的导管分子处于发育初期，为活细胞状态；S3：所选取的嫩梢长度在5cm至10cm之间；S4：所述嫩梢生长于靠近苗木个体主干处的叶片呈螺旋状排列的枝条上；消毒处理包括如下步骤：S1：采用酒精棉擦拭外植体表面；S2:剪取擦拭过的外植体，所述外植体带有叶片、嫩芽；S3：将剪取的外植体置于流水下冲洗0.5h～1h；S4：将冲洗后的外植体置于超净工作台中，采用医用酒精消毒10～60S；S5：将采用酒精消毒后的外植体采用无菌水冲洗2～4遍；S6：将冲洗后的外植体采用漂白水消毒30min～60min，所述漂白水由一份体积的商品漂白水添加四份体积的无菌水勾兑配置而成；S7：将漂白水消毒后的外植体采用无菌水冲洗3～4次。通过采用上述技术方案，所选取的外植体中，导管尚未发育成熟，为活细胞，能够分裂增殖，其木薄壁组织对外植体的难以起到阻碍分裂的作用。将外植体消毒能够有效去除外植体表面的细菌，减小细菌污染培养基的可能性；同时，不对外植体进行搅碎的操作，能够减少破碎细胞的数量，以便降低细菌污染外植体的可能性，在后期的培养中，细菌的数量少，难以对培养基中的外植体起到污染、损害的作用，以利于外植体正常增殖，提高了实验成功的可能性，以便得到更高的生根率、成活率，便于批量生产。进一步设置：根据权利要求1所述的一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：将消毒后的外植体置于芽诱导培养基中启动培养，启动培养包括如下步骤：S1：将消毒后的外植体上部分叶片切除，切除部分为叶片总量的2\3；S2:将除叶后的外植体切成段状，每一段的长度限制在1cm～2cm；S3：将切段后的外植体置于芽诱导培养基中，并置于22～25℃室温下培养；S4：培养室中设置光照条件，光照强度范围为1500LUX～2500LUX；S5：培养室中设置光照条件，光照周期为16小时光照，8小时暗培养；S6：外植体在恒温培养室中启动培养4周～8周，腋芽萌发。通过采用上述技术方案，在允许范围内，将叶片切除越多，外植体上用于叶片生长的能耗越少，所省能量能够提供给分裂增殖中的细胞，使其具有充分的养分。留下部分叶片后，这些留下的叶片能够进行光合作用提供养分。20℃～28℃的恒温为植物生长最合适的温度，便于细胞生长。光照的周期性既能够实现植物的光合作用，也能够实现植物的呼吸作用，使植物正常生长，降低植物的死亡率，利于批量生产。进一步设置：所述芽诱导培养基的成分配比如下：WPM2.7g/L2IP1.0～3.5mg/L蔗糖15～45g/L琼脂5.5～7.0g/L所述芽诱导培养基的溶剂采用水，所述芽诱导培养基的PH值为5.50～6.00；通过采用上述技术方案，蔗糖为主要营养来源，琼脂起到固定的作用，使培养基整体结构稳固，利于植物在培养基中正常生长、利于后期批量成活、批量生产。进一步设置：对已经过启动培养的外植体进行增殖培养，增殖培养包括如下步骤：S1：将腋芽接种至固体增殖培养基中，并置于22～25℃室温下培养；S2：将接种至增殖培养基中的腋芽置于黑暗条件下进行暗培养40h～60h，然后再给予光照；S3：对暗培养后的腋芽给光，光强范围为1500～3000LUX，光照周期为光照16小时，暗培养8小时；S4：将腋芽增殖培养4周～8周；获得团芽；S5：每4～8周将增殖得到的团芽分割为单个芽；S6：将分割得到的单个芽重新接种于固体增殖培养基中。通过采用上述技术方案，腋芽具有高增殖性，将整团腋芽放置于培养基中培养，能够尽量保持腋芽的原本的生长状态，相较于切开或搅碎的操作，对外植体的损害更小。当腋芽增殖到团芽时，团芽中的细胞种类已经变多，易发生细胞变态，向成熟植株发展，此时将单个芽重新接种后，能够继续使用增殖能力最高的部分，达到高效增殖的目的；高效增殖后，成活数量随之变多，以达到批量生产的目的。进一步设置：所述固体增殖培养基的成分配比如下：WPM2.7g/L2IP1.0～3.5mg/LZT1.5～4.0mg/L蔗糖20～30g/L琼脂5.0～7.0g/L所述固体增殖培养基的PH值为5.50～6.00。通过采用上述技术方案，2IP为异戊烯基腺嘌呤核苷，在生物试剂中，采用该浓度的配方，能够使腋芽的增殖过程人为可控，增殖倍率为3～4倍，且芽体健壮，玻璃化率低于0.1%。进一步设置：对增殖得到的团芽进行壮苗培养，壮苗培养包括如下步骤：S1：将增殖培养所得的团芽分割后转移至壮苗培养基中；S2：对分割后的团芽提供光照，光强范围为2000LUX～3000LUX，光照周期为光照16小时，暗培养8小时；S3：将分割后的团芽置于10℃～30℃的环境中；S4：将分割后的团芽培养5周～7周，得到生长高度为3cm的无根组培苗。通过采用上述技术方案，分割后的团芽具有高增殖能力，且团芽中细胞种类多，此时细胞的状态已经确定，细胞能够开始生长，直至团芽长成完整植株，得到组培苗。培养5周及以上后，组培苗的生长状态趋于稳定，不易发生死苗等现象，利于植物后期批量成活、批量生产。进一步设置：所述壮苗培养基的成分配比如下：1/2WPM1.35g/L蔗糖20～30g/L琼脂5.0～7.0g/L活性炭0.5～1.0g/L所述壮苗培养基的PH值为5.50～6.00。通过采用上述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：步骤为：选取外植体，对外植体进行表面消毒，接种到启动培养基中并给以合适的环境条件进行启动培养，转接到增殖培养基中并给以合适的培养条件进行腋芽增殖培养，对增殖腋芽进行分割并转接到壮苗培养基中给以合适培养条件进行壮苗培养，将经过壮苗培养的无根组培苗接种到生根培养基中并给予合适的培养条件进行生根诱导，所剪取的外植体保留有外植体的高增殖能力；筛选剪取外植体包括如下步骤：S1：选取外植体并对外植体消毒所需的苗木个体为生长年限为3～4年之间的健壮苗木个体，该苗木无病虫害、无机械损伤、无叶片畸形；S2：选取苗木个体于春季自然萌发的嫩梢，所述嫩梢中木质素低于20%，所述嫩梢中的导管分子处于发育初期，为活细胞状态；S3：所选取的嫩梢长度在5cm至10cm之间；S4：所述嫩梢生长于靠近苗木个体主干处的叶片呈螺旋状排列的枝条上；消毒处理包括如下步骤：S1：采用酒精棉擦拭外植体表面；S2:剪取擦拭过的外植体，所述外植体带有叶片、嫩芽；S3：将剪取的外植体置于流水下冲洗0.5h～1h；S4：将冲洗后的外植体置于超净工作台中，采用医用酒精消毒10～60S；S5：将采用酒精消毒后的外植体采用无菌水冲洗2～4遍；S6：将冲洗后的外植体采用漂白水消毒30 min～60min，所述漂白水由一份体积的商品漂白水添加四份体积的无菌水勾兑配置而成；S7：将漂白水消毒后的外植体采用无菌水冲洗3～4次。...

【技术特征摘要】
1.一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：步骤为：选取外植体，对外植体进行表面消毒，接种到启动培养基中并给以合适的环境条件进行启动培养，转接到增殖培养基中并给以合适的培养条件进行腋芽增殖培养，对增殖腋芽进行分割并转接到壮苗培养基中给以合适培养条件进行壮苗培养，将经过壮苗培养的无根组培苗接种到生根培养基中并给予合适的培养条件进行生根诱导，所剪取的外植体保留有外植体的高增殖能力；筛选剪取外植体包括如下步骤：S1：选取外植体并对外植体消毒所需的苗木个体为生长年限为3～4年之间的健壮苗木个体，该苗木无病虫害、无机械损伤、无叶片畸形；S2：选取苗木个体于春季自然萌发的嫩梢，所述嫩梢中木质素低于20%，所述嫩梢中的导管分子处于发育初期，为活细胞状态；S3：所选取的嫩梢长度在5cm至10cm之间；S4：所述嫩梢生长于靠近苗木个体主干处的叶片呈螺旋状排列的枝条上；消毒处理包括如下步骤：S1：采用酒精棉擦拭外植体表面；S2:剪取擦拭过的外植体，所述外植体带有叶片、嫩芽；S3：将剪取的外植体置于流水下冲洗0.5h～1h；S4：将冲洗后的外植体置于超净工作台中，采用医用酒精消毒10～60S；S5：将采用酒精消毒后的外植体采用无菌水冲洗2～4遍；S6：将冲洗后的外植体采用漂白水消毒30min～60min，所述漂白水由一份体积的商品漂白水添加四份体积的无菌水勾兑配置而成；S7：将漂白水消毒后的外植体采用无菌水冲洗3～4次。2.根据权利要求1所述的一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：将消毒后的外植体置于芽诱导培养基中启动培养，启动培养包括如下步骤：S1：将消毒后的外植体上部分叶片切除，切除部分为叶片总量的2\3；S2:将除叶后的外植体切成段状，每一段的长度限制在1cm～2cm；S3：将切段后的外植体置于芽诱导培养基中，并置于22～25℃室温下培养；S4：培养室中设置光照条件，光照强度范围为1500LUX～2500LUX；S5：培养室中设置光照条件，光照周期为16小时光照，8小时暗培养；S6：外植体在恒温培养室中启动培养4周～8周，腋芽萌发。3.根据权利要求2所述的一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：所述芽诱导培养基的成分配比如下：WPM2.7g/L2IP1.0～3.5mg/L蔗糖15～45g/L琼脂5.5～7.0g/L所述芽诱导培养基的PH值为5.50～6.00。4.根据权利要求3所述的一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法，其特征在于：对已经过启动培养的外植体进行增殖培养，增殖培养包括如下步骤：S1：将腋芽接种至固体增殖培养基中，并置于22～25℃室温下培养；S2：将接种至增殖培养基中的腋芽置于黑暗条件下进行暗培养40h～60h，然后再给予光照；S3：对暗培养后的腋芽给...

【专利技术属性】
技术研发人员：王婷婷，胡春宏，常苹，季翔，王晨，
申请(专利权)人：江苏东郁园林科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32