一种基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置及迭代重构方法制造方法及图纸

本发明专利技术公开了一种基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置与迭代重构方法，包括LED阵列、载物台、聚光镜、显微物镜、成像筒镜、相机，所述的LED阵列设置在聚光镜的前焦面上；所述LED阵列上第i个点亮的LED单元发出的光经过聚光镜汇聚变成平行光照射在待测样品上，该待测样品被放置在载物台上，透过待测样品的一部分衍射光被显微物镜收集，并经过成像筒镜汇聚照射相机的成像平面，形成的光强图由相机记录下来。本发明专利技术既保证了照明方向的编程可控，同时也保证了照明数值孔径最高可达到1.20，从而获得高达0.15μm的重构分辨率。

【技术实现步骤摘要】
一种基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置及迭代重构方法
本专利技术属于光学显微成像技术，特别是一种基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置及迭代重构方法。
技术介绍
在显微成像领域，更高的分辨率一直是追求的目标，但是在提高分辨率的同时存在一个关键性问题，那就是并没有随分辨率一起提高的显微镜的空间带宽积。从成像系统角度看，为了实现高分辨率，必须增加显微物镜的数值孔径，但空间分辨率的提高与视场的扩大往往是一对难以调和的矛盾。简言之，就是在低倍镜下可以看到被检物体的全貌，换成高倍物镜时，就只能看到被检物体的很小一部份。目前，为了突破分辨率与视场大小难以同时兼顾的矛盾，常见的方法是采用常规显微镜系统配合高精度机械扫描和后期空域图像拼接方法将多个小视场高分辨率图像拼接融合生成一幅大视场高分辨率图像(孙西钊,王震,李攀,李建勋,王文合.适用于结核杆菌抗酸染色图像拼接的装置:中国,2013205777012[P].2013-09-17.)。但是由于引入了机械移动装置，所以系统成像时的稳定性和成像速度又成为一对难以调和的矛盾，提高扫描速度必将影响成像稳定性。所以，想要突破分辨率与视场本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置，其特征在于包括LED阵列(1)、载物台(2)、聚光镜(3)、显微物镜(5)、成像筒镜(6)、相机(7)，所述的LED阵列(1)设置在聚光镜(3)的前焦面上，并且LED阵列(1)的中心处于显微物镜(5)的光轴上；显微物镜(5)的后焦面与成像筒镜(6)的前焦面重合，相机(7)的成像平面放置在成像筒镜(6)的后焦面上，成像时载物台(2)上的待测样品(4)调节到显微物镜(5)的前焦面位置，构成无穷远校正成像系统；所述LED阵列(1)上第i个点亮的LED单元(8)发出的光经过聚光镜(3)汇聚变成平行光照射在待测样品(4)上，该待测样品(4)被放置在载物...

【技术特征摘要】
1.一种基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置，其特征在于包括LED阵列(1)、载物台(2)、聚光镜(3)、显微物镜(5)、成像筒镜(6)、相机(7)，所述的LED阵列(1)设置在聚光镜(3)的前焦面上，并且LED阵列(1)的中心处于显微物镜(5)的光轴上；显微物镜(5)的后焦面与成像筒镜(6)的前焦面重合，相机(7)的成像平面放置在成像筒镜(6)的后焦面上，成像时载物台(2)上的待测样品(4)调节到显微物镜(5)的前焦面位置，构成无穷远校正成像系统；所述LED阵列(1)上第i个点亮的LED单元(8)发出的光经过聚光镜(3)汇聚变成平行光照射在待测样品(4)上，该待测样品(4)被放置在载物台(2)上，透过待测样品(4)的一部分衍射光被显微物镜(5)收集，并经过成像筒镜(6)汇聚照射相机(7)的成像平面，形成的光强图由相机(7)记录下来。2.根据权利要求1所述的基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置，其特征在于所述的显微物镜(5)数值孔径为NAobj，且满足其中f为聚光镜(3)的焦距，d为相邻LED单元(8)之间的间距，该d<2mm；所述的LED阵列(1)照明波长为λ，显微物镜(5)放大率为Mag，像元尺寸为Δxcam，且满足3.根据权利要求1所述的基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置，其特征在于相机(7)为彩色或单色相机，如果是单色相机，在成像时，LED阵列(1)中每个LED单元(8)分别发出红或绿或蓝单色光，用单色相机依次记录下所有单色图像即可；如果是彩色相机，在成像时，LED阵列(1)中每个LED单元(8)同时发出红绿蓝三色光，用彩色相机记录下所有彩色图像。4.根据权利要求1所述的基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置，其特征在于在聚光镜(3)和待测样品(4)之间设置显微镜油。5.一种利用权利要求1至4任一项所述装置的基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像迭代重构方法，其特征在于步骤如下：步骤一，LED单元(8)亮度标定，将LED阵列(1)作为基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置的照明光源，顺次点亮LED阵列(1)中每一个LED单元(8)，照射空白待测样品(4)后使用高倍物镜采集相对应的图像，并计算每个LED单元(8)在红绿蓝三个波段对应的归一化亮度校正系数；步骤二，LED阵列(1)位置标定，将分辨率板作为待测样品(4)，LED阵列(1)作为基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置的照明光源，顺次点亮LED阵列(1)中每一个LED单元(8)，照射待测样品(4)后分别采集聚焦下和离焦h距离下相对应的图像，然后通过亚像素配准算法计算每个LED单元(8)在红绿蓝三个波段对应的照明角度，再通过非线性回归确定LED阵列位置；步骤三，原始图像采集，将LED阵列(1)作为基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像装置的照明光源，顺次点亮LED阵列(1)中每一个LED单元(8)，照射待测样品(4)后采集相对应的低分辨率原始图像；步骤四：原始图像预处理，包括阈值去噪和亮度校正，首先根据相机(7)的暗电流噪声平均值作为阈值，对拍摄的低分辨率原始图像进行阈值去噪，得到去噪后低分辨率图像，然后再将每一幅去噪后低分辨率图像除以步骤一中获得的归一化亮度校正系数，得到亮度校正后的低分辨率图像；步骤五：高分辨率图像初始化，将所有亮度校正后的低分辨率图像中的低分辨率明场图像相加平均，然后再通过上采样来初始化高分辨率图像的振幅与相位；步骤六：迭代重构，采用基于频域叠层孔径与像素合并迭代方法将所有亮度校正后的低分辨率图像在频域中逐一进行合成孔径运算，并逐步减小更新系数，以代价函数值为判据，当代价函数小于一个给定的阈值时，停止迭代，此时的高分辨率图像的振幅与相位就是最终得到的大视场高分辨率显微图像。6.根据权利要求5所述的基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像迭代重构方法，其特征在于在步骤一中：整个LED阵列(1)中共包含N个LED单元，N>261，每个LED单元(8)分别发出红绿蓝三种颜色的单色光，共计拍摄3N幅低分辨率图像，则第i个LED单元在颜色c下对空白待测样品拍摄到的图像记作其中i＝1,2,...,N，c＝r,g,b，r为实空间的二维坐标r＝(x,y)，然后计算每幅图像的平均光强成为每个LED单元在红绿蓝三个波段的平均亮度，其中Npixel为一幅图像中的像素总个数，LED阵列(1)中心的LED单元(8)所对应的平均亮度为则每个LED单元在红绿蓝三个波段对应的归一化亮度校正系数为7.根据权利要求5所述的基于大照明数值孔径的大视场高分辨率显微成像迭代重构方法，其特征在于步骤二中：首先，LED阵列(1)照射待测样品(4)后分别采集聚焦下和离焦h距离下相对应的聚焦图像和离焦图像根据角谱衍射理论将LED阵列(1)中心的LED单元(8)对应的聚焦图像沿光轴数值传播h距离，得到数值离焦图像然后通过亚像素配准算法计算每个离焦图像相对于数值离焦图像的偏移量(PYx,PYy)，则第i个LED单元所对应的照明光的空间频率矢量为其中，(ux,uy)为沿x,y方向的空间频率，λ为照明光的波长；最后再通过非线性回归确定LED阵列位置，公式为：xi＝d[cos(θ)mi+sin(θ)ni]+Δxyi＝d[-sin(θ)mi+cos(θ)ni]+Δy

【专利技术属性】
技术研发人员：陈钱，孙佳嵩，左超，顾国华，冯世杰，张玉珍，李加基，张佳琳，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32