一种利用分子标记制备富含莱菔子苷的花椰菜新种质的方法技术

本发明专利技术公开一种利用分子标记制备富含莱菔子苷的花椰菜新种质的方法，通过杂交一自交一回交的方法，以分子标记技术为基础，通过标记辅助选择与传统表型选择相结合，将高莱菔子苷含量的青花菜自交系中的相关基因片段转入综合性状优良花椰菜自交系，获得具有较高莱菔子苷含量的花椰菜新种质。本发明专利技术利用分子标记可在苗期选择莱菔子苷含量高的单株，淘汰含量低的单株，用地少，工作量小，且可以避免常规选育方法中花球中莱菔子苷含量测定方法周期长、工作量大、易受环境影响等缺点，并可以对不同的花椰菜自交系进行高莱菔子苷含量的创制，使莱菔子苷含量的被动选育转变成主动筛选和创制，为莱菔子含量高的花椰菜新品种选育提供丰富的原始材料。

A new method of cauliflower germplasm using molecular markers to prepare rich glycosides of semen Raphani

The invention discloses a method of using molecular markers to prepare rich semen Raphani glycosides cauliflower germplasm, through a method of hybrid inbred backcross, using molecular marker technology as the foundation, with the traditional phenotypic marker assisted selection to choose the combination of the fragments of genes related to high semen Raphani glycoside content of broccoli inbred lines in turn good comprehensive characters of cauliflower inbred lines, New Germplasm with high semen Raphani glycoside content of cauliflower. The invention can select individual using molecular markers of semen Raphani glycoside content high in seedling stage, plant out of low content, with less, small workload, and can avoid the conventional breeding method of semen Raphani curd glucoside content determination method of long cycle, large workload and disadvantages affected by environment, and can create high radish sub glycosides content of different cauliflower inbred lines, the passive breeding of semen Raphani glycoside content change into active screening and creation, provide plenty of original materials for cauliflower breeding new varieties with high content of semen raphani.

【技术实现步骤摘要】
一种利用分子标记制备富含莱菔子苷的花椰菜新种质的方法
本专利技术属于植物学领域，涉及一种花椰菜，具体来说是一种利用分子标记制备富含莱菔子苷的花椰菜新种质的方法。
技术介绍
随着现代工业的发展，环境污染加剧，近10年来我国癌症发病数在持续上升，癌症总死亡水平上升了31%。其中肺癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌、直肠癌等与生活方式密切相关的癌症上升迅速，在城市中尤其明显。因此关于蔬菜中的抗癌物质与人类常见癌症关系的研究越来越受到科学家们的重视。国内外大量医学和营养学研究表明，经常摄食青花菜等十字花科蔬菜，可有效降低肺癌、直肠癌、乳腺癌及前列腺癌等多种癌症的发病率，这种抗癌功效与其含有硫苷有关，其降解产物异硫氰酸盐能够诱导脱毒PhaseII酶活性，而这类酶能够抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞程序化死亡，并且能够使动物和人体内一些致毒物质形成极性较强易于排泄的结合物。国内外大量研究表明，4-甲基亚磺酰丁基硫苷(glucoraphanin,又称葡萄糖莱菔子苷，简称RAA，以下简称莱菔子苷)降解产生的异硫氰酸盐-萝卜硫素（sulforaphane，简称SF，1-异硫氰酸-4-甲磺酰基丁烷），是迄今为止发现的最强烈的PhaseⅡ酶诱导剂，而青花菜是十字花科蔬菜中莱菔子苷含量最丰富的蔬菜，但不同青花菜品种中莱菔子苷及其酶解产物萝卜硫素含量存在极显著差异，最高可达百倍以上。花椰菜，又称白花菜、菜花，与青花菜同属十字花科芸薹属甘蓝种，原产地中海沿岸，最早在19世纪中末期从上海地区和东南沿海传入中国，现是国内老百姓餐桌上的主要蔬菜之一，其营养丰富，富含蛋白质、脂肪、碳水化合物、食物纤维、维生素、类黄酮及矿物质，目前全国栽培面积达300多万亩，上海市种植面积10万亩以上，是国内出口创汇，增加农民收入的重要蔬菜品种之一。虽然与青花菜亲缘关系很近，但研究表明，花椰菜中莱菔子苷含量很低，青花菜花球中莱菔子苷含量是花椰菜花球的十倍甚至百倍以上，如果能够选择具有高莱菔子苷含量的青花菜品种，并利用分子标记辅助手段快速将其中控制莱菔子苷合成的基因片段转入花椰菜，使花椰菜表现出较高的莱菔子苷含量，创造具有更高抗癌防癌功能的花椰菜新种质，可以让人们在饮食中就能够轻松地摄取更多的抗癌物质，降低多种癌症的发生率，提高人民生活质量，同时也可以为培育出莱菔子苷含量高的花椰菜新品种提供丰富的原始材料，加速了具有抗癌保健功能的花椰菜新品种的选育过程，具有极大的社会意义。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本所述的这种利用分子标记制备富含莱菔子苷的花椰菜新种质的方法要解决现有技术中的花椰菜中莱菔子苷含量很低，抗癌防癌功能不佳的技术问题。本专利技术提供了一种利用分子标记制备富含莱菔子苷的花椰菜新种质的方法，包括以下步骤：1)选择莱菔子苷含量高于5μmol/g干重的青花菜自交系与花椰菜自交系配置杂交F1代种子，F1代植株自交得到F2代种子，播种F2代种子得到F2代植株；2)在步骤1）所述的F2代植株中选择花球、株型和叶形均趋向于花椰菜的单株，利用与莱菔子苷合成基因有关的SSR标记、ELONG-InDel和ALK-InDel标记对这些单株进行第一次前景选择，获得与青花菜亲本标记带型一致的F2代单株，以对应的花椰菜亲本为轮回亲本回交，获得BC1F2代种子，播种BC1F2代种子得到BC1F2代植株；3)在苗期，第二次利用与莱菔子苷合成基因有关的SSR标记、ELONG-InDel和ALK-InDel标记对步骤2）所述的BC1F2代植株进行前景选择，与青花菜亲本标记带型一致的BC1F2代单株入选，种植于田间，结合田间筛选，获得与父本相似度较高的BC1F2代单株，这些单株再与轮回父本回交，得到BC2F2代种子，播种BC2F2代种子得到BC2F2代植株；4)在苗期，第三次利用与莱菔子苷合成基因有关的SSR标记、ELONG-InDel和ALK-InDel标记对步骤3）所述的BC2F2代植株进行前景选择，与青花菜亲本标记带型一致的BC2F2代单株入选，种植于田间，结合田间筛选，获得与父本相似度较高的BC2F2代单株，这些单株再与轮回父本回交，得到BC3F2代种子，播种BC3F2代种子得到BC3F2代植株；5)在苗期，第四次利用与莱菔子苷合成基因有关的SSR标记、ELONG-InDel和ALK-InDel标记对步骤4）所述的BC3F2代植株进行前景选择，与青花菜亲本标记带型一致的BC3F2代单株入选，种植于田间，结合田间筛选，获得与父本相似度高的BC3F2代单株，同时测定BC3F2代单株花球中的莱菔子苷含量，含量最高者入选，入选单株自交留种，后代稳定表现的即为培育制备的高莱菔子苷含量花椰菜新种质。本专利技术通过杂交一自交一回交的方法，以分子标记技术为基础，通过标记辅助选择与传统表型选择相结合，将高莱菔子苷含量的青花菜自交系中的相关基因片段转入综合性状优良花椰菜自交系，获得同时具有较高莱菔子苷含量和综合园艺和经济性状较好的花椰菜新种质。本专利技术利用分子标记可在苗期选择莱菔子苷含量高的单株，淘汰含量低的单株，用地少，工作量小，且可以避免常规选育方法中花球中莱菔子苷含量测定方法周期长、工作量大、易受环境影响等缺点。本专利技术和已有技术相比，其技术进步是显著的。本专利技术可以对不同的花椰菜自交系进行高莱菔子苷含量的制备，使莱菔子苷含量的被动选育转变成主动筛选和制备，可以为莱菔子含量高的花椰菜新品种选育提供丰富的原始材料，加速了具有抗癌保健功能的花椰菜新品种的选育过程，具有极大的社会意义。本专利技术的方法可以为高莱菔子苷含量花椰菜新品种选育服务，满足目前的市场需求。附图说明图1是SSR引物FITO512在双亲及高低含量池的扩增情况；注：M为Marker，泳道1-4分别为高莱菔子苷含量亲本LBS、低莱菔子苷含量亲本LI，高莱菔子苷含量池，低莱菔子苷含量池，泳道5-9为组成低莱菔子苷含量池的五个单株，泳道10-14为组成低莱菔子苷含量的五个品种。图2是ELONG-InDel标记在青花菜和花椰菜中的扩增；注：M为Marker，泳道1-8为高莱菔子苷含量青花菜材料，泳道9-16为花椰菜材料图3：ALK-InDel标记在青花菜和花椰菜中的扩增；注：M为Marker，泳道1-8为高莱菔子苷含量青花菜材料，泳道9-16为花椰菜材料具体实施方式实施例1：与莱菔子苷合成基因有关的SSR标记和InDel标记的筛选获得1.SSR标记的获得1.1材料青花菜高代自交系LBS和LI及其杂交F2代群体，LBS莱菔子苷含量高为7.16μmol/g干重，LI莱菔子苷含量低为0.24μmol/g干重。1.2高低莱菔子苷含量基因池的建立所有F2代单株，于花球商品采收期，对商品花球采用三点法混合取样（即球顶和边缘共3点），真空冷冻干燥，用磨样机粉碎均匀，于-18℃冰箱保存。利用反相高效液相色潽法，对所有F2代单株花球中莱菔子苷含量进行测定。根据测定结果选取高含量的5个单株和低含量的5个单株，分别提取基因组DNA，DNA提取采用修改的CTAB法进行，具体步骤为：取适量（0.2--0.5g）新鲜嫩叶于1.5ml离心管中，加入650ul预热至65℃的CTAB缓冲液，用磨样机研磨，于65℃水浴60min，每10min上下颠倒混匀，冷却至室温后加入650本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用分子标记制备富含莱菔子苷的花椰菜新种质的方法，包括以下步骤：选择莱菔子苷含量高于5μmol/g干重的青花菜自交系与花椰菜自交系配置杂交F1代种子，F1代植株自交得到F2代种子，播种F2代种子得到F2代植株；在步骤1）所述的F2代植株中选择花球、株型和叶形均趋向于花椰菜的单株，利用与莱菔子苷合成基因有关的SSR标记、ELONG‑InDel和ALK‑InDel标记对这些单株进行第一次前景选择，获得与青花菜亲本标记带型一致的F2代单株，以对应的花椰菜亲本为轮回亲本回交，获得BC1F2代种子，播种BC1F2代种子得到BC1F2代植株；在苗期，第二次利用与莱菔子苷合成基因有关的SSR标记、ELONG‑InDel和ALK‑InDel对步骤2）所述的BC1F2代植株进行前景选择，与青花菜亲本标记带型一致的BC1F2代单株入选，种植于田间，结合田间筛选，获得与父本相似度较高的BC1F2代单株，这些单株再与轮回父本回交，得到BC2F2代种子，播种BC2F2代种子得到BC2F2代植株；在苗期，第三次利用与莱菔子苷合成基因有关的SSR标记ELONG‑InDel和ALK‑InDel标记对步骤3）所述的BC2F2代植株进行前景选择，与青花菜亲本标记带型一致的BC2F2代单株入选，种植于田间，结合田间筛选，获得与父本相似度较高的BC2F2代单株，这些单株再与轮回父本回交，得到BC3F2代种子，播种BC3F2代种子得到BC3F2代植株；在苗期，第四次利用与莱菔子苷合成基因有关的SSR标记、ELONG‑InDel和ALK‑InDel标记对步骤4）所述的BC3F2代植株进行前景选择，与青花菜亲本标记带型一致的BC3F2代单株入选，种植于田间，结合田间筛选，获得与父本相似度高的BC3F2代单株，同时测定BC3F2代单株花球中的莱菔子苷含量，含量最高者入选，入选单株自交留种，后代稳定表现的即为培育制备的高莱菔子苷含量花椰菜新种质。...

【技术特征摘要】
1.一种利用分子标记制备富含莱菔子苷的花椰菜新种质的方法，包括以下步骤：选择莱菔子苷含量高于5μmol/g干重的青花菜自交系与花椰菜自交系配置杂交F1代种子，F1代植株自交得到F2代种子，播种F2代种子得到F2代植株；在步骤1）所述的F2代植株中选择花球、株型和叶形均趋向于花椰菜的单株，利用与莱菔子苷合成基因有关的SSR标记、ELONG-InDel和ALK-InDel标记对这些单株进行第一次前景选择，获得与青花菜亲本标记带型一致的F2代单株，以对应的花椰菜亲本为轮回亲本回交，获得BC1F2代种子，播种BC1F2代种子得到BC1F2代植株；在苗期，第二次利用与莱菔子苷合成基因有关的SSR标记、ELONG-InDel和ALK-InDel对步骤2）所述的BC1F2代植株进行前景选择，与青花菜亲本标记带型一致的BC1F2代单株入选，种植于田间，结合田间筛选，获得与父本相似度较高的BC1F2代单株，这些单株再与轮回...

【专利技术属性】
技术研发人员：姚雪琴，谢祝捷，李光庆，刘春琴，
申请(专利权)人：上海市农业科学院，上海科园种子有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31