防治甘薯蔓割病的尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株制造技术

本发明专利技术提供了一种防治甘薯蔓割病的尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株，所述菌株为尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株MG103‑4(Fusarium oxysporum f.sp.batatas)，于2016年08月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016435。

【技术实现步骤摘要】
防治甘薯蔓割病的尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株
本专利技术具体涉及一种防治甘薯蔓割病的尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株。
技术介绍
甘薯蔓割病是由尖孢镰刀菌甘薯专化型Fusariumoxysporumf.sp.batatas引起的甘薯维管束真菌病害。此病在我国主要分布在东南沿海各省，其中在浙江、福建危害最为严重，一般能使甘薯减产10％～20％，重者达50％。现有甘薯生产上采用最为主要的防治手段就是选育抗病品种，但是实际育种中总是难以将优良的生产性状与抗病性状相结合，如在福建连城大规模种植的“90日早”、“岩薯7-3”不抗薯割病，需要采用药剂等其他措施进行甘薯蔓割病的防治。随着人们对食品和环境安全要求的提高，生物防治作为一种绿色安全的措施越来越受到人们的重视，因而，探索甘薯蔓割病的生物防治技术有利于促进甘薯产业的发展。现阶段尖孢镰刀菌生防因子种类包括真菌(木霉Trichoderma、丛枝菌根真菌Arbuscularmycorrhizae、非致病尖孢镰刀菌nonpathogenicFusariumoxysporum、淡紫拟青霉Paecilomyceslilacinus)，细菌(假单胞杆菌Pseudomonas、芽胞杆菌Bacillus)、植物提取物、放线菌等。由于非致病型镰刀菌菌株和致病菌株需要相似的生态条件，有相似的定殖行为和营养需求，可与致病型菌株产生更强的竞争作用，因而镰刀菌非致病菌株是防效最好、最稳定的生防因子之一。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题，在于提供一种防治甘薯蔓割病的尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株。本专利技术是这样实现的：一种防治甘薯蔓割病的尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株，所述菌株为尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株MG103-4(Fusariumoxysporumf.sp.batatas)，于2016年08月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCM2016435。本专利技术的优点在于：对甘薯蔓割病具有生物防治效果，在PDA培养基上表现出对致病菌营养空间竞争的拮抗效果，此生防菌株处理过甘薯后，能显著降低蔓割病的发病率；在T-DNA中加入了GFP绿色荧光蛋白标记基因，便于生防菌的环境行为监测；本专利技术为从自然环境中分离生防菌存在的问题提供了解决的方法，也为其它作物上尖孢镰刀菌引起病害的生防菌开发提供借鉴。附图说明下面参照附图结合实施例对本专利技术作进一步的说明。图1是本专利技术中pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp用EcoRI和SalI酶切后的电泳图。图2是本专利技术中尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株MG103-4的产孢能力的示意图。MG—尖孢镰刀菌甘薯专化型菌株MGMG50-5—尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株MG103-4具体实施方式菌株保藏尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株MG103-4(Fusariumoxysporumf.sp.batatasMG103-4)，于2016年08月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCCM2016435供试菌株:尖孢镰刀菌甘薯专化型菌株MG(Fusariumoxysporumf.sp.batatasMG)，于2016年08月29日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址为湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山，保藏编号为CCTCCM2016432。尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株MG103-4的具体制备方法如下：1.1试验材料甘薯品种新种花(蔓割病敏感型)由本研究室保存种植，pCT74(上海北诺生物科技有限公司)，pCAMBIA1300(北京华越洋生物科技有限公司)，pVOK21由中国农业大学惠赠，pMD18-T购自Takara-宝生物工程(大连)有限公司；所有限制性内切酶BstXI，SalI，XhoI和EcoRI均购自Takara-宝生物工程(大连)有限公司，潮霉素B购自Roche公司，特美汀购自上海前尘生物科技有限公司，乙酰丁香酮、MES、混合纤维微孔滤膜均购自生工生物工程(上海)股份有限公司，其余农杆菌转化用药品均购自国药集团化学试剂有限公司。1.2构建双元荧光载体pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp首先用EcoRI和SalI两种限制性内切酶分别酶切质粒pCT74和pCAMBIA1300，回收获得SalI-ptoxA-gfp-nos-EcoRI和SalI-pCAMBIA1300-EcoRI，两个片段相连接后构建完成载体pCAMBIA1300-gfp；然后用XhoI和BstXI两种限制性内切酶酶切质粒pCAMBIA1300-gfp(去除CaMV35S-hph片段)，并且以质粒pKOV21为模板(用真菌中常用的ptrpC启动子启动潮霉素B抗性基因表达)，PCR扩增ptrpC-hph片段，在片段首尾分别加入XhoI和BstXI酶切位点，引物为HphRC-F-XhoI和ptrpCRC-R-BstXI。HphRC-F-XhoI：5′-CTCGAGCTATTTCTTTGCCCTCGGAC-3′(如SEQIDNO：1所示)；ptrpCRC-R-BstXI：5′-CCAACATGGTGGGTCGACAGAAGATGATATTGAAGG-3′(如SEQIDNO：2所示)。反应体系：总体积50μL，2×GCBufferI25μL,dNTPMixture(2.5mmol/Leach)8μL,引物HphRC-F-XhoI(10μmol/L)1.25μL,引物ptrpCRC-R-BstXI(10μmol/L)1.25μL,模板pKOV21(体系中质粒终浓度为0.1-10ng)1.5μL,LAtaq0.5μL，用ddH2O补齐50μL，其中，试剂均购自Takara-宝生物工程(大连)有限公司。反应程序：第一步94℃预变性1min；第二步94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸2min，第二步30个循环；第三步72℃延伸10min。PCR产物通过连接反应插入pMD18-T载体后，获得pMD18-ptrpC-hph并送往铂尚生物技术有限公司测序，pMD18-ptrpC-hph序列如SEQIDNO：3所示，进行序列比对，测序结果正确后，用XhoI和BstXI酶切pMD18-ptrpC-hph质粒并回收获得BstXI-ptrpC-hph-XhoI片段。最后将pCAMBIA1300-gfp骨架与BstXI-ptrpC-hph-XhoI片段连接获得pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp载体。在pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp质粒构建完成后，首先对pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp质粒进行EcoRI和SalI酶切初步确定SalI-ptoxA-gfp-nos-EcoRI片段已经连入pCAMBIA1300-ptrpC-hph骨架中(见图1，其中标识1代表marker标准分子量，标识2是pCAMBIA1300-ptrpC-hph-gfp质粒经酶切验证的条带)，又进行PCR扩增ptrpC-hph片段(具体见1.2的试验方法)和GFP片段。PCR扩增GFP片段的反应程序和反应体系如下：引物P28：5′-TAGTGGACTG本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种防治甘薯蔓割病的尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株，其特征在于：所述菌株为尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株MG103‑4(Fusarium oxysporum f.sp.batatas)，于2016年08月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2016435。

【技术特征摘要】
1.一种防治甘薯蔓割病的尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株，其特征在于：所述菌株为尖孢镰刀菌甘薯专化型非致病突变菌株MG103-4(Fusar...

【专利技术属性】
技术研发人员：张鸿，林志坚，许泳清，纪荣昌，李国良，刘中华，李华伟，林赵淼，邱思鑫，邱永祥，罗文彬，汤浩，余华，
申请(专利权)人：福建省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：福建,35