gp96蛋白在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用制造技术

本发明专利技术提供gp96蛋白在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用，所述gp96蛋白为热休克蛋白gp96。本发明专利技术首次将热休克蛋白gp96用于治疗特发性血小板减少性紫癜药物的制备中，实验证明，热休克蛋白gp96具有诱导调节性T细胞的产生、降低脾脏系数、提高血小板的数量的功能。因此，热休克蛋白gp96对治疗自身免疫性血小板减少性紫癜和/或缓解自身免疫性血小板减少性紫癜的症状具有重要的应用价值。

Application of gp96 protein in preparing medicine for treating idiopathic thrombocytopenic purpura

The present invention provides the use of gp96 protein in the preparation of medicine for treating idiopathic thrombocytopenic purpura. The gp96 protein is a heat shock protein gp96. The present invention first heat shock protein gp96 for the treatment of idiopathic thrombocytopenic purpura drug preparation, experiment proved that the heat shock protein gp96 can induce the generation of regulatory T cells, reduce the spleen coefficient and improve the number of platelet function. Therefore, heat shock protein gp96 has important value in the treatment of autoimmune thrombocytopenic purpura and / or remission of autoimmune thrombocytopenic purpura.

【技术实现步骤摘要】
gp96蛋白在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用
本专利技术属于生物医药领域，具体地说，涉及热休克蛋白gp96在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用。
技术介绍
自身免疫性血小板减少性紫癜，是一种自身免疫性出血性疾病，以血小板减少、骨髓巨核细胞数正常或增加伴成熟受阻，以及缺乏任何原因包括外源的或继发性因素为特征，又称为特发性血小板减少性紫癜(idiopathicthrombocytopenicpurpura，ITP)。血小板减少性紫癜虽发病率较低，但死亡率却较高。血小板减少性紫癜的检验指标除作血常规外尚需查血小板计数(急性型一般低于20×109/L，慢性型多在(30～80)×109/L之间)，并注意观察血小板形态，促凝血时间，血块收缩时间，凝血酶原时间，血小板表面相关免疫球蛋白(PAIg)测定，抗人球蛋白试验，补体测定，毛细血管脆性试验，骨髓象检查。血小板减少性紫癜药物治疗首选糖皮质激素。此外，经多种药物治疗4-6个月，不能控制症状或仍有反复发作者，可考虑脾摘除。凡摘脾后又发作者，仍可考虑用糖皮质激素及免疫抑制剂。热休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)是一类在生物进化中高度保守且广泛存在于原核及真核生物中的蛋白质。HSP根据同源程度和分子量大小可分为HSP110、HSP90、HSP70、HSP60、HSP40、小分子HSP和泛素等多个亚家族。热休克蛋白(Heatshockprotein，HSP)gp96属于HSP90亚家族的成员，该蛋白是细胞内质网上含量最丰富的热休克蛋白。研究表明gp96在免疫调节中具有重要的作用。低剂量的外源gp96注射小鼠能显著激活小鼠的免疫系统，高剂量的外源gp96注射小鼠后显著抑制小鼠的免疫系统。gp96调节免疫功能可能与调节性T细胞(Treg)相关。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供gp96蛋白(即热休克蛋白gp96)在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用。为了实现本专利技术目的，本专利技术提供的gp96蛋白在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用，其中，所述gp96蛋白为：i)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或ii)SEQIDNO:2去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列；或iii)在i)或ii)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；或iv)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，或SEQIDNO:2去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。编码所述热休克蛋白gp96的核酸分子，可为d1)或d2)或d3)或d4)：d1)SEQIDNO:1自5’端起第4位至2352位所示的DNA分子；d2)SEQIDNO:1所示的DNA分子；d3)与d1)或d2)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子；d4)在严格条件下与d1)或d2)限定的核苷酸序列杂交，且编码所述热休克蛋白gp96的DNA分子。所述严格条件为在含0.1％SDS的0.1×SSPE或含0.1％SDS的0.1×SSC溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜。所述药物的功能为如下A1)至A3)中的至少一种：A1)诱导调节性T细胞的产生；A2)提高血小板的数量；A3)降低脾脏系数。本专利技术还提供gp96蛋白在制备诱导调节性T细胞产生的药物中的应用。本专利技术所述调节性T细胞包括CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞等。本专利技术还提供gp96蛋白在制备升血小板药物中的应用。本专利技术还提供用于治疗特发性血小板减少性紫癜的药物，其有效成分为gp96蛋白。本专利技术还提供用于诱导调节性T细胞产生的药物，其有效成分为gp96蛋白。本专利技术还提供一种升血小板药物，其有效成分为gp96蛋白。本专利技术所述药物的单次剂量单元为小鼠免疫单次剂量为100-400μg/18-22g体重，人免疫剂量为100-1500μg/人次。施用对象为人和哺乳动物。优选所述哺乳动物为小鼠。更优选BALB/C小鼠。本专利技术所述热休克蛋白gp96的获得方式为：1)细胞和组织中天然纯化；或2)利用酵母菌表达重组蛋白；或3)利用昆虫细胞表达重组蛋白。本专利技术首次将热休克蛋白gp96用于治疗特发性血小板减少性紫癜药物的制备中，实验证明，热休克蛋白gp96具有诱导调节性T细胞的产生、降低脾脏系数、提高血小板的数量的功能。因此，热休克蛋白gp96对治疗自身免疫性血小板减少性紫癜和/或缓解自身免疫性血小板减少性紫癜的症状具有重要的应用价值。附图说明图1为本专利技术实施例1中人胎盘组织制备的gp96提取物的SDS-PAGE和Westernblot鉴定结果。图2为本专利技术实施例1中利用汉逊酵母表达重组gp96蛋白的SDS-PAGE和Westernblot鉴定结果。图3为本专利技术实施例1中利用昆虫细胞表达重组gp96蛋白的SDS-PAGE和Westernblot的鉴定结果。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。BALB/C小鼠购自南京模式动物研究所；BALB/C小鼠在实施例中简称小鼠。豚鼠，雌性，体重350g，共10只，购自南京模式动物研究所。弗氏完全佐剂(DH-1341-1)和弗氏不完全佐剂(DH-1341-2)购自北京鼎国生物技术有限公司。草酸氨购自广东光华科技股份有限公司。获取小鼠脾脏淋巴细胞的具体方法参考文献：ZhenLiu，XinghuiLi，LipengQiu，etal.TregsuppressCTLresponsesuponimmunizationwithHSPgp96.Eur.J.mmunol，2009，39(11)：3110–3120.HepG2细胞(人肝癌细胞)购自ATCC(美国菌种保藏中心)，产品目录号为HB-8065TM。Sf9细胞为Invitrogen公司产品，产品目录号为11496-015。CellfectinIIreagent为Lifetechnologies公司产品，产品目录号为10362-100。质粒pFastBacTM1为Invitrogen公司产品，产品目录号为10359-016。gp96单克隆抗体为SantaCruz公司产品，产品目录号为sc-56399。辣根过氧化物酶标记的山羊抗大鼠的单克隆抗体为北京中杉金桥生物技术有限公司产品，产品目录号为ZB-2307。HiTrap-QSepharose离子交换层析柱为GE公司产品，产品目录号为17-5053-01。Superdex20010/300GL分子筛层析柱为GE公司产品，产品目录号为17517501。大肠杆菌DH10Bac感受态细胞为北京原平皓生物技术有限公司产品，产品目录号为CL108-01。FITC-anti-CD3、PE-anti-CD4、Percp-Cy5.5-anti-CD25、固定/破膜剂和APC-anti-Foxp3均为eBioscience公司产品，产品目录号分别为本文档来自技高网...

【技术保护点】
gp96蛋白在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用，其中，所述gp96蛋白为：i)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；或ii)SEQ ID NO:2去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列；或iii)在i)或ii)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；或iv)SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列，或SEQ ID NO:2去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。

【技术特征摘要】
1.gp96蛋白在制备治疗特发性血小板减少性紫癜药物中的应用，其中，所述gp96蛋白为：i)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；或ii)SEQIDNO:2去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列；或iii)在i)或ii)的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白；或iv)SEQIDNO:2所示的氨基酸序列，或SEQIDNO:2去掉第一个蛋氨酸后的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸得到的具有相同功能的蛋白。2.gp96蛋白在制备诱导调节性T细胞产生的药物中的应用。3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述调节性T细胞包括CD4+CD25+FOXP3+调节性T细胞。4...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟颂东，李鑫，鞠莹，
申请(专利权)人：北京热休生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11