一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的制备方法技术

本发明专利技术公开一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：纤维连接蛋白单克隆抗体1作为捕获探针，利用蛋白质巯基与金形成稳定的共价键，自组装固定在电极表面；在纤维连接蛋白存在下，单克隆抗体捕获探针与纤维连接蛋白结合；末端标记有生物素的纤维连接蛋白多克隆抗体再与纤维连接蛋白结合；亲和素标记的辣根过氧化物酶可通过与多克隆抗体标记的生物素结合，使HRP固定在电极表面；将构建的电极置于含TMB和H2O2的溶液中，在酶催化下，TMB被氧化生成双偶氮联苯胺类物质，并在电极上产生电信号，即制备了一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器。具有简便、经济、灵敏度高，特异性强特点。

Method for preparing electrochemical immunosensor for detecting fibronectin

Preparation method of electrochemical immunosensor discloses a fibronectin detection of the invention, which comprises the following steps: fibronectin monoclonal antibody as the capture probe 1, to form a stable covalent bond with protein thiol and gold, self-assembly immobilized on the electrode surface; in the presence of fibronectin, monoclonal antibody capture probe and fibronectin binding; fibronectin biological end labeling the polyclonal antibody with fibronectin binding affinity; horseradish peroxidase labeled by biotin labeled with polyclonal antibody to HRP, immobilized on the electrode surface; the electrode is placed on the construction of the solution containing TMB and H2O2, catalyzed by enzyme, TMB was oxidized to BDB substances, and generate an electrical signal to the electrodes, which were prepared for detecting fibronectin White electrochemical immunosensor. The utility model has the advantages of simplicity, economy, high sensitivity and strong specificity.

【技术实现步骤摘要】
一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的制备方法
本专利技术涉及生物免疫技术、电化学免疫传感器
，尤其涉及一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的制备方法。
技术介绍
纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)是指结构上类似，免疫性相同的一组糖蛋白，由两条近似相同的单体分子在羧基末端通过一对二硫键交联形成“V”字形二聚体结构。根据体内分布不同，FN分为细胞型(cFN)与血浆型(pFN)2种。纤维连接蛋白广泛存在于细胞外基质、血浆及其他体液中，作为一种重要的粘附分子，能与肝素、胶原蛋白以及细胞表面整合素家族受体结合，参与细胞的粘附、增殖、迁移、炎症反应，维持血管完整性等多项生理过程，与许多疾病有着密切的联系。FN可促进单核巨噬系统活性，具有调理素作用，保持网状内皮系统功能、及时清除血液循环中颗粒性有害物质。现有技术中，对于人体血浆中纤维连接蛋白(FN)水平的检测方法主要有两种，一种是酶联免疫吸附法(ELISA)，另一种是放射免疫扩散法。ELISA法检测时间长，操作步骤复杂，检测成本高；放射免疫扩散法虽检测时间短，但需有放射性保护。故两种检测方法都不能实现快速、简便、灵活地检测的血浆纤维连接蛋白(FN)水平，不能满足临床的需求。为了解决现有纤维连接蛋白检测技术的不足，亟需研究一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术第一目的是提供了一种检测FN的电化学免疫传感器；其中，工作电极为金电极，依次组装纤维连接蛋白抗体1捕获探针、牛血清蛋白(BSA)封闭剂、纤维连接蛋白抗原、生物素修饰的抗体2层及亲和素修饰的辣根过氧化物酶所得。本专利技术第二目的是提供了一种检测FN的电化学免疫传感器的制备方法。本专利技术的目的是这样实现的，所述的检测FN的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：将纤维连接蛋白的单克隆抗体1固定在电极的表面，利用抗体与抗原的特异性免疫反应捕获纤维连接抗原蛋白，再通过捕获在电极上的抗原进一步结合末端标记有生物素的多克隆抗体2，最后利用生物素与亲和素的特异性反应，将标记有亲和素的辣根过氧化酶结合到电极表面，实现该特异性免疫反应与电化学酶联放大的高灵敏性相结合的电化学免疫传感器的制备。所述电化学传感器的工作电极的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：（1）金电极表面预处理：将金电极表面进行抛光处理，使其呈镜面状，并用N2吹干，备用；（2）孵育纤维连接蛋白的单克隆抗体1：先将纤维连接蛋白抗体加到步骤（1）制备得到的工作电极表面上孵育1-15h，再用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗掉与金电极结合不够稳定及未结合的纤维连接蛋白抗体，室温下晾干，备用；（3）BSA封闭非特异性吸附位点：将步骤（2）所制得电极在一定反应条件下将其浸泡在一定浓度牛血清蛋白溶液中，反应15-30min，封闭非特异性吸附位点，再用pH7.4的PBS洗掉与金电极结合不够稳定及未结合的牛血清蛋白，室温下晾干，备用；（4）抗原与金电极上纤维连接蛋白的单克隆抗体1的特异性免疫反应：将不同浓度的纤维连接蛋白溶液加到步骤（3）所制得的电极表面上，在一定反应条件下抗原特异性结合到纤维连接蛋白的单克隆抗体1上，再用pH7.4的PBS洗掉与纤维连接蛋白的单克隆抗体1结合不够稳定及未结合的纤维连接蛋白，室温下晾干，备用；（5）末端标记有生物素的多克隆抗体2与抗原结合：将一定浓度的末端标记有生物素的多克隆抗体2加到步骤（4）所制得的电极表面上，在一定条件下抗原与末端标记有生物素的多克隆抗体2发生特异性免疫反应，再用pH7.4的PBS洗掉与抗原结合不够稳定及未结合的末端标记有生物素的多克隆抗体2，室温下晾干，备用；（6）标记有亲和素的辣根过氧化物酶(s-HRP)与末端标记有生物素的多克隆抗体2结合：将足量的s-HRP溶液加到步骤（5）所制得的电极表面上，在一定条件下标记有亲和素的辣根过氧化物酶中的亲和素与末端标记有生物素的多克隆抗体2中的生物素特异性结合，再用pH7.4的PBS洗掉与生物素结合不够稳定及未结合的s-HRP，即制得检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器。步骤（4）反应条件为温度25～45℃，时间30～90min。步骤（5）反应条件为温度37℃，时间30～120min。步骤（6）反应条件为室温，时间15～30min。步骤（2）构建电化学免疫传感器中，所述纤维连接蛋白单克隆抗体的浓度为50～200μg/mL。所述步骤（3）构建电化学免疫传感器中，所述的牛血清蛋白质量浓度为0.5wt%～2wt%。所述步骤（5）构建电化学免疫传感器中，所述的末端标记有生物素的多克隆抗体2浓度为60～300μg/mL。本专利技术上述的方法制得的检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器。本专利技术上述的方法制得的电化学免疫传感器或权利要求9所述的检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器应用于特异性检测纤维连接蛋白，不受甲状腺球蛋白、胎牛血清白蛋白、癌胚抗原或前列腺癌抗原等干扰。更具体地说，本专利技术所述的检测FN的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：（1）金电极表面处理：先将Au电极在有0.05μmAl2O3溶液的麂皮上打磨抛光呈镜面状，再依次于1:1的HNO3、无水乙醇和蒸馏水中超声清洗，取出后用足量双蒸水洗净，然后置于稀硫酸溶液中扫描CV，进一步清理电极表面，待扫描信号稳定后取出，足量双蒸水冲洗干净，高纯N2吹干，备用。（2）孵育纤维连接蛋白的单克隆抗体1：先将纤维连接蛋白单克隆抗体1滴加到步骤（1）制备得到的工作电极上，于4℃条件下孵育1～15h，再用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS)洗掉与金电极结合不够稳定及未结合的纤维连接蛋白抗体1，室温下晾干，备用；（3）BSA封闭非特异性吸附位点：将步骤（2）所制得的电极浸泡在一定浓度牛血清蛋白溶液中，于37℃水浴锅中孵育15min，再用pH7.4的PBS洗掉与金电极结合不够稳定及未结合的牛血清蛋白,室温下晾干，备用；（4）抗原与金电极上捕获探针抗体1的特异性免疫反应：将不同浓度的纤维连接蛋白溶液加到步骤（3）所制得的电极表面上，在一定反应条件下抗原特异性结合已固定于金电极上的抗体1，再用pH7.4的PBS洗掉与抗体结合不够稳定及未结合的纤维连接蛋白，室温下晾干，备用；（5）末端标记生物素的多克隆抗体2与抗原特异性免疫反应：将一定浓度的抗体2滴加到步骤（6）所制得的电极表面上，在一定条件下抗原与抗体2发生特异性免疫反应后，再用pH7.4的PBS洗掉与抗原结合不够稳定及未结合的抗体2，室温下晾干，备用；（6）标记有亲和素的辣根过氧化物酶(s-HRP)与标记有生物素的抗体2的特异性结合：将足量的s-HRP溶液加到步骤（5）所制得电极表面上，在一定条件下，亲和素与生物素发生特异结合，再用pH7.4的PBS洗掉与生物素结合不够稳定及未结合的s-HRP，制得检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器，即工作电极。其中步骤（4）反应条件为温度25～45℃，时间30～90min；优选地步骤（4）反应条件为温度37℃，时间60min；步骤（5）反应条件为温度37℃，时间30～120min；优选地步骤（5）反应条件为温度37℃，时间60min；步骤（5）反应条件为室温，时间15～30min；优选地步骤（6）反应条件为室本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：将纤维连接蛋白的单克隆抗体1固定在电极的表面，利用抗体与抗原的特异性免疫反应捕获纤维连接抗原蛋白，再通过捕获在电极上的抗原进一步结合末端标记有生物素的多克隆抗体2，最后利用生物素与亲和素的特异性反应，将标记有亲和素的辣根过氧化酶结合到电极表面，实现该特异性免疫反应与电化学酶联放大的高灵敏性相结合的电化学免疫传感器的制备。

【技术特征摘要】
1.一种检测纤维连接蛋白的电化学免疫传感器的制备方法，包括如下步骤：将纤维连接蛋白的单克隆抗体1固定在电极的表面，利用抗体与抗原的特异性免疫反应捕获纤维连接抗原蛋白，再通过捕获在电极上的抗原进一步结合末端标记有生物素的多克隆抗体2，最后利用生物素与亲和素的特异性反应，将标记有亲和素的辣根过氧化酶结合到电极表面，实现该特异性免疫反应与电化学酶联放大的高灵敏性相结合的电化学免疫传感器的制备。2.根据权利要求1所述电化学传感器的工作电极的制备方法，其特征在于具体包括如下步骤：（1）金电极表面预处理：将金电极表面进行抛光处理，使其呈镜面状，并用N2吹干，备用；（2）孵育纤维连接蛋白的单克隆抗体1：先将纤维连接蛋白抗体加到步骤（1）制备得到的工作电极表面上孵育1-15h，再用pH7.4的磷酸盐缓冲溶液洗掉与金电极结合不够稳定及未结合的纤维连接蛋白抗体，室温下晾干，备用；（3）BSA封闭非特异性吸附位点：将步骤（2）所制得电极在一定反应条件下将其浸泡在一定浓度牛血清蛋白溶液中，反应15-30min，封闭非特异性吸附位点，再用pH7.4的PBS洗掉与金电极结合不够稳定及未结合的牛血清蛋白，室温下晾干，备用；（4）抗原与金电极上纤维连接蛋白的单克隆抗体1的特异性免疫反应：将不同浓度的纤维连接蛋白溶液加到步骤（3）所制得的电极表面上，在一定反应条件下抗原特异性结合到纤维连接蛋白的单克隆抗体1上，再用pH7.4的PBS洗掉与纤维连接蛋白的单克隆抗体1结合不够稳定及未结合的纤维连接蛋白，室温下晾干，备用；（5）末端标记有生物素的多克隆抗体2与抗原结合：将一定浓度的末端标记有生物素的多克隆抗体2加到步骤（4）所制得的电极表面上，在一定条件下抗原与末端标记有生物素的多克隆抗体2发生特异性免疫反应，再用pH7.4的PBS洗掉与抗原结合不够稳定及未结合的末端标记有生...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈元仲，田辉云，刘爱林，吴勇，
申请(专利权)人：福建医科大学附属协和医院，
类型：发明
国别省市：福建,35