一种芍药属木本植物离体对活体嫁接的方法技术

本发明专利技术涉及一种芍药属木本植物离体对活体嫁接的方法，本发明专利技术的方法克服了芍药属木本植物牡丹离体生根植株移栽无法土壤建成的难题，缓解了牡丹优质育种材料的供需矛盾，可大大缩短牡丹育种进程。

In vitro graft method of woody plants of Paeonia

The invention relates to a genus of woody plants in vitro in vivo grafting, the method of the invention overcomes the problem of woody plants in the genus Paeonia peony in vitro rooting plants were transplanted to soil built, alleviate the contradiction between supply and demand of high quality peony breeding materials, can greatly shorten the breeding process of peony.

【技术实现步骤摘要】
一种芍药属木本植物离体对活体嫁接的方法
本专利技术属于植物学领域，更具体地，本专利技术涉及一种芍药属木本植物离体对活体嫁接的方法。
技术介绍
牡丹(PaeoniaSufruticosa)，别名富贵花、百两金、木芍药、鼠姑、鹿韭，洛阳花，为芍药科芍药属木本植物，落叶灌木。该物种亦花(观赏)亦药(丹皮)，浑身是宝，具有重要的研究意义。2015年，牡丹被列为国家十三五拟拓展的转基因物种之一。然而，牡丹离体快繁或转基因的抗性芽生根频率低下，而且根的质量不好，土壤移栽不能存活。因此，牡丹离体再生或转基因抗性芽苗无法建成为自然植株，是目前业界公认的世界性难题。嫁接，即接穗插入砧木，是一种传统而经典的植物繁殖方法。选择亲和力强的砧木和接穗是嫁接成功与否的关键。亲和力是指砧木和接穗经嫁接而能愈合的能力，一般情况下，亲缘关系越近，亲合力越强，嫁接的成活率也就越高。砧木和接穗的活力与健壮度、嫁接时机及嫁接技术等都是影响嫁接效率的重要因素。传统的嫁接法存在成本高、嫁接后成活率低、病虫害多等缺陷。尽管现有技术中，牡丹嫁接技术已经被广泛应用，但是人们一般会采集带有多个芽的枝条作为接穗、与砧木进行嫁接，也即以自然生长枝条来与砧木进行嫁接。而嫁接技术是否可被应用于牡丹离体生根植株的培育生长并不清楚。因此，本领域还需要探索牡丹离体芽苗嫁接的可行性以及培养条件。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种芍药属木本植物离体对活体嫁接的方法。在本专利技术的第一方面，提供一种牡丹离体对活体的微嫁接方法，所述的方法包括：(1)以含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液浸泡牡丹种子，浸泡后的种子进行灭菌处理；(2)将(1)的种子去除种壳，在添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的基本培养基中培养，之后转入基本培养基中，形成离体芽苗；(3)将(2)的离体芽苗在含有萘乙酸和多效唑溶液中浸泡后，嫁接到砧木上，形成牡丹离体芽苗与砧木的微嫁接体；和(4)种植(3)的微嫁接体，获得存活的植株。在本专利技术的一个优选例中，步骤(2)中，将(1)的种子去除种壳，在添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的WPM基本培养基中培养，之后转入WPM基本培养基中，形成离体芽苗在本专利技术的另一优选例中，步骤(3)中，所述的砧木如下获得：在3、4、5或10月将3-6年生的牡丹或芍药实生苗起苗，修剪掉主干，并在切口处灭菌处理，种植培养；较佳地，所述的牡丹是凤丹或紫斑牡丹；较佳地，所述的灭菌处理是以硫磺粉涂抹切口处。在本专利技术的另一优选例中，步骤(3)中，离体芽苗嫁接到砧木上包括：将离体芽苗嫁接到牡丹或芍药实生苗的鳞芽切口上，在嫁接的缝隙处注入含有萘乙酸和多效唑的溶液以促进愈合。在本专利技术的另一优选例中，步骤(1)中，所述含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液中包括：100±30mg/L赤霉素(GA3)，1±0.3mg/L6苄基腺嘌呤，5±2mg/L硝酸钙。更佳地，所述含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液中包括：100±20mg/L赤霉素，1±0.2mg/L6苄基腺嘌呤，5±1mg/L硝酸钙；更佳地，包括：100±10mg/L赤霉素，1±0.1mg/L6苄基腺嘌呤，5±0.5mg/L硝酸钙。在本专利技术的另一优选例中，步骤(2)中，所述的添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的WPM基本培养基中，添加：5±2mg/L赤霉素，1±0.3mg/L6苄基腺嘌呤，1±0.3mg/L硝酸钙。更佳地，所述的添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的WPM基本培养基中，添加：5±1mg/L赤霉素，1±0.2mg/L6苄基腺嘌呤，1±0.2mg/L硝酸钙；更佳地，添加：5±0.5mg/L赤霉素，1±0.1mg/L6苄基腺嘌呤，1±0.1mg/L硝酸钙。在本专利技术的另一优选例中，步骤(2)中，在添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的WPM基本培养基中培养3-5周(较佳地3.5-4.5周，更佳地4周)；之后转入WPM基本培养基中培养10-14周(较佳地11-13周，更佳地12周)，形成离体芽苗；较佳地，在转入WPM基本培养基中培养后，每3-5周继代一次(较佳地每3.5-4.5周继代一次，更佳地每4周继代一次)。在本专利技术的另一优选例中，所述的含有萘乙酸和多效唑溶液包括：0.05-1mg/L萘乙酸，0.005-0.1mg/L多效唑。更佳地，所述的含有萘乙酸和多效唑溶液包括：0.1-0.5mg/L萘乙酸，0.01-0.05mg/L多效唑。在本专利技术的另一优选例中，步骤(1)中，所述的灭菌处理包括：以70％酒精和/或0.1％升汞浸泡，以无菌水或蒸馏水冲洗。在在本专利技术的另一优选例中，步骤(1)中，浸泡时间为18-30小时，较佳地为20-28小时，如24小时。本专利技术的另一优选例中，步骤(3)中，将离体芽苗切成薄片后在含有萘乙酸和多效唑的溶液中浸泡。在本专利技术的另一优选例中，步骤(4)中，微嫁接体种植于播种基质中，该播种基质是泥炭、菜园土和珍珠岩为3∶6∶1的基质；较佳地，该播种基质在使用前经灭菌处理；较佳地，经121℃灭菌处理。在本专利技术的另一优选例中，步骤(3)中，在含有萘乙酸和多效唑的溶液中浸泡的时间为10-30min；较佳地为15-25min；更佳地为20分钟。在本专利技术的另一优选例中，步骤(3)中，嫁接后，离体芽苗与砧木之间用parafilm膜固定。本专利技术的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。附图说明图1A、苗龄为12周的离体芽苗。图1B、切成薄片的离体接穗。图1C、存活2周的离体对活体微嫁接。图1D、存活4周的离体对活体微嫁接。具体实施方式为了克服牡丹离体生根植株移栽无法土壤建成的难题，尽快缓解牡丹优质育种材料的供需矛盾，大大缩短牡丹育种进程，本专利技术人致力于牡丹离体对活体的微嫁接研究，获得了离体诱导的牡丹芽苗嫁接到自然生长牡丹植株的多项技术参数，构建了牡丹离体对活体的微嫁接体系。离体芽苗的制备牡丹的离体芽苗的制备过程主要包括以下步骤：(1)以含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液浸泡牡丹种子，浸泡后的种子进行灭菌处理；和(2)将(1)的种子去除种壳，在添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的WPM基本培养基中培养，之后转入WPM基本培养基中，形成离体芽苗。作为本专利技术的优选方式，步骤(1)中，所述含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液中包括：100±30mg/L赤霉素(GA3)，1±0.3mg/L6苄基腺嘌呤，5±2mg/L硝酸钙。更优选地，所述含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液中包括：100±20mg/L赤霉素，1±0.2mg/L6苄基腺嘌呤，5±1mg/L硝酸钙；更佳地，包括：100±10mg/L赤霉素，1±0.1mg/L6苄基腺嘌呤，5±0.5mg/L硝酸钙。本专利技术人在实践中发现，对于牡丹的种子进行该浸泡处理有利于后续的种子萌发和芽苗生长。作为本专利技术的优选方式，步骤(2)中，所述的添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的WPM基本培养基中，添加：5±2mg/L赤霉素，1±0.3mg/L6苄基腺嘌呤+1±0.3mg/L硝酸钙。更优选地，所述的添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的WPM基本培养基中，添加：5±1mg/L赤霉素，1±0.2mg/L6苄基腺嘌呤+1±0.2mg/L硝酸钙；更佳地，添加：5±0.5mg/L赤霉素，1±0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种牡丹离体对活体的微嫁接方法，其特征在于，所述的方法包括：(1)以含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液浸泡牡丹种子，浸泡后的种子进行灭菌处理；(2)将(1)的种子去除种壳，在添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的基本培养基中培养，之后转入基本培养基中，形成离体芽苗；(3)将(2)的离体芽苗在含有萘乙酸和多效唑的溶液中浸泡后，嫁接到砧木上，形成牡丹离体芽苗与砧木的微嫁接体；和(4)种植(3)的微嫁接体，获得存活的植株。

【技术特征摘要】
1.一种牡丹离体对活体的微嫁接方法，其特征在于，所述的方法包括：(1)以含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液浸泡牡丹种子，浸泡后的种子进行灭菌处理；(2)将(1)的种子去除种壳，在添加赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的基本培养基中培养，之后转入基本培养基中，形成离体芽苗；(3)将(2)的离体芽苗在含有萘乙酸和多效唑的溶液中浸泡后，嫁接到砧木上，形成牡丹离体芽苗与砧木的微嫁接体；和(4)种植(3)的微嫁接体，获得存活的植株。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的砧木如下获得：在3、4、5或10月将3-6年生的牡丹或芍药实生苗起苗，修剪掉主干，并在切口处灭菌处理，种植培养；较佳地，所述的牡丹是凤丹或紫斑牡丹；较佳地，所述的灭菌处理是以硫磺粉涂抹切口处。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)中，离体芽苗嫁接到砧木上包括：将离体芽苗嫁接到牡丹或芍药实生苗的鳞芽切口上，在嫁接的缝隙处注入含有萘乙酸和多效唑的溶液以促进愈合。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中，所述含有赤霉素、6苄基腺嘌呤和硝酸钙的溶液中包括：100±30mg/L赤霉素，1±0.3mg/L6苄基腺嘌呤，5±2mg/L硝...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱木兰，胡永红，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31