一种玉米抗逆相关基因ZmDi19‑5及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种玉米抗逆相关基因ZmDi19‑5及其应用，所述基因具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述基因的编码蛋白具有如SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。该基因为一种新的植物抗逆相关基因，能够提高植物抗逆性能，该基因的发现丰富了抗逆相关基因的资源，对玉米抗逆新品种的选育具有重要意义。

A maize resistance related gene ZmDi19 5 and its application

The invention discloses a maize resistant related gene ZmDi19 and its application 5, the nucleotide sequence of SEQ gene with ID as shown in NO.1, the gene encoding protein has the amino acid sequence of SEQ ID NO.2 shown. The gene is a new plant stress related gene, which can improve the stress resistance of plants. The discovery of this gene enriches the resources of stress related genes and has important significance for the breeding of New Maize Varieties with resistance to stress.

【技术实现步骤摘要】
一种玉米抗逆相关基因ZmDi19-5及其应用
本专利技术涉及的是基因工程
，尤其涉及的是一种玉米抗逆相关基因ZmDi19-5及其应用。
技术介绍
玉米不仅作为三大粮食物之一，也可作为重要的能源材料。从玉米中生产出的乳酸，经过化学反应可生成高分子材料(聚乳酸)，能替代化工塑料，是能够被生物降解的环保材料，在社会和经济发展中具有重要的战略意义。目前，我国玉米生产总量已超过小麦产量，位于我国第二大粮食作物,其重要性已不言而喻。我国大部分玉米种植地区受到干旱和盐渍的胁迫，每年因此而减产，直接影响了旱区和盐渍地的农业生产。因此，增强玉米抗旱和耐盐的能力已成为我国农业研究重要问题之一。目前选育抗旱和耐盐的新品种方法有很多，相比于传统育种，转基因技术是实现育种目标见效快的方法。该技术关键是挖掘出与干旱和盐胁迫相关的基因，并分析生物学功能和抗逆机理。在模式植物拟南芥中，通过基因缺失突变体进行分析其基因功能已成为主流，相比较玉米而言，获得单基因缺失突变体的方法比较困难，使得对基因功能研究受到一定的限制，因此通过异源转化获得转基因材料方法，在抗逆基因的功能研究中发挥了重要的作用。植物的抗逆应答机制离不开转录因子的调控。有报道显示，植物的抗逆性能的体现并不是某一个转录因子单独调控的结果，是由多个转录因子协同表达共同影响决定的复杂生物学性状。转录因子的功能调控和植物抗逆机制的应答，为作物分子抗逆育种的开展提供了有力支持，为作物综合抗逆性能的提高和改良提供了理论依据。研究表明C2H2锌指蛋白家族的转录因子主要参与调控植物的生长发育以及植物的抗逆性相关活动。Di19蛋白不仅是C2H2锌指蛋白家族的一员，同时也是干旱诱导蛋白的成员。目前已经在拟南芥、棉花、大豆、小麦、水稻等植物中克隆出Di19基因，但在玉米中有关Di19基因的转录因子报道还没有。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种玉米抗逆相关基因ZmDi19-5及其应用，以提供一种新的可用于玉米抗逆遗传改良的基因。本专利技术是通过以下技术方案实现的：本专利技术提供了一种玉米抗逆相关基因ZmDi19-5，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，全长720bp。本专利技术还提供了上述玉米抗逆相关基因ZmDi19-5在降低或提高植物抗逆性中的应用。本专利技术还提供了上述玉米抗逆相关基因ZmDi19-5的编码蛋白，其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，具有239个氨基酸。本专利技术还提供了一种植物过量表达载体，所述植物过量表达载体为pCAMBIA1301载体，所述pCAMBIA1301载体的多克隆位点区域依次连接有35S启动子、ZmDi19-5基因和终止子。本专利技术还提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述宿主细胞含有所述植物过量表达载体，或其基因组中整合有外源的所述ZmDi19-5基因的正向或反向序列。本专利技术还提供了一种提高植物抗逆性的方法，所述方法是将所述ZmDi19-5基因导入植物的细胞、组织或器官中，获得抗逆性强的转基因植株新品种。进一步地，所述植物包括玉米、水稻、小麦、拟南芥。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术提供了一种玉米抗逆相关基因ZmDi19-5及其应用，该基因为一种新的植物抗逆相关基因，丰富了抗逆相关基因的资源，对玉米抗逆新品种的选育具有重要意义。附图说明图1为ZmDi19-5基因凝胶电泳检测结果图；图2为ZmDi19-5蛋白与其他作物的Di19蛋白家族成员的系统进化树分析结果图；图3为ZmDi19-5基因过表达载体构建图谱；图4为盐胁迫下转基因拟南芥与野生型拟南芥根生长情况柱状分析图；图5为盐胁迫下转基因拟南芥与野生型拟南芥株高情况柱状分析图；图6为盐胁迫下转基因拟南芥与野生型拟南芥丙二醛含量测定结果柱状图；图7为盐胁迫下转基因拟南芥与野生型拟南芥相对电导率的测定结果柱状图；图8为干旱处理下转基因拟南芥与野生型拟南芥过氧化氢酶测定结果柱状图；图9为干旱处理下转基因拟南芥与野生型拟南芥丙二醛含量测定结果柱状图；图10为干旱处理下转基因拟南芥与野生型拟南芥叶片相对含水量测定结果柱状图。具体实施方式实施例11、材料本实施例所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，所用的试剂等材料，如无特别说明，均为市售购买产品。2、方法2.1ZmDi19-5基因的克隆选择玉米B73自交系为实验材料，提取玉米叶片组织RNA，并反转录成cDNA备用。从玉米数据库检索获取ZmDi19-5的生物学信息，以ZmDi19-5基因序列为模板设计特异性扩增引物，同时结合克隆载体上的多克隆酶切位点，选择KpnI和BamHI酶切位点引入ZmDi19-5序列两端，特异性扩增引物序列如下所示：SEQIDNO.3：ZmDi19-5-F：5’-GGGGTACCATGGATTCCGACCTCTGGAT-3’SEQIDNO.4：ZmDi19-5-R：5’-CGGGATCCCTAGTCTTCAAAAATGGTGGTG-3’以cDNA为模板，ZmDi19-5-F和ZmDi19-5-R为引物，利用TAKARA公司生产的高保真酶PrimerSTARMaxPremix(2×)进行PCR扩增反应，PCR扩增反应体系如下：PCR扩增程序为：98℃预变性10min，98℃变性10s，62℃退火5s，72℃延伸1min，共30个循环后，加入0.5μL的Taq酶，以给3’端加上PolyA尾巴，最后，72℃下继续延伸10min完成反应，获得的PCR产物用质量比为1％的琼脂糖凝胶电泳检测拍照。结果如图1所示，图中可以看出，目标基因条带清晰，且大小与预测结果一致，说明PCR结果良好。进一步地，将目标基因用Axygen公司的胶回收试剂盒进行切胶回收，与T1Simple载体连接后转化到大肠杆菌Trans5α感受态细胞中，用KpnI和BamHI进行双酶切验证，筛选阳性克隆子，获得T1+ZmDi19-5载体，并送去上海生工公司测序。2.2ZmDi19-5基因的生物信息学分析测序结果经Mega4.0软件与数据库中的序列比对后，与SEQIDNO.1所示的核苷酸序列一致，说明成功克隆获得ZmDi19-5基因。通过在线程序PFAM对ZmDi19-5基因的编码蛋白进行结构域特征分析，结果表明其蛋白结构域含有zf-Di19(位于第49个到102个氨基酸位置)和Di19_C(位于第123个到236个氨基酸位置)，说明其为一种Di19蛋白。利用DNAMAN软件，将其氨基酸序列与已知的水稻OsDi19-4的氨基酸序列比对，结果表明，ZmDi19-5基因不仅含有两个Cys2/His2型锌指蛋白结构域，还与OsDi19-4的氨基酸序列的同源性达到74％左右，而OsDi19-4基因被报道是转录因子。由此预测ZmDi19-5属于干旱诱导蛋白家族的转录因子一类。利用Mega4.0软件，将已报道功能的拟南芥和水稻的Di19蛋白，与玉米Di19蛋白进行系统进化树分析，结果如图2所示，图中，ZmDi19-5与OsDi19-4的亲缘关系最近，而OsDi19-4基因已经被证明参与调控植物的抗旱机制，这一发现为后续的ZmDi19-5基因功能验证奠定基础。2.3ZmDi19-5基因过表达载体的构建以pCAMBIA1301为原始载体，在其多克隆位点的EcoRI和Sal本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种玉米抗逆相关基因ZmDi19‑5，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种玉米抗逆相关基因ZmDi19-5，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。2.一种如权利要求1所述的玉米抗逆相关基因ZmDi19-5在降低或提高植物抗逆性中的应用。3.一种如权利要求1所述的玉米抗逆相关基因ZmDi19-5的编码蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。4.一种植物过量表达载体，其特征在于，所述植物过量表达载体为pCAMBIA1301载体，所述pCAMBIA1301载体的多克隆位点区域依次连接有35S启...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵阳，张敏，程备久，胡芳秀，顾龙江，江海洋，
申请(专利权)人：安徽农业大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34