一种适用于聚乙二醇化蛋白质纯度检测的方法技术

本发明专利技术涉及一种检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，该方法以分子筛色谱法检测，流动相中添加有：1)主链具有三个或三个以上碳原子、可溶于水相及有机相的短链脂肪醇；或2)与修饰用PEG具有相同分子量或者分子量更大的PEG修饰剂。本发明专利技术提供的流动相添加剂相对于常规添加剂，可有效提高检测方法的灵敏度，能检出现有方法无法检出聚乙二醇化蛋白质中的杂质，更好地控制药品质量。

Method for detecting protein purity of polyethylene glycol

The invention relates to a method for the detection of pegylated protein purity, the method by molecular sieve chromatography detection, the mobile phase is added: 1) main chain with three or more than three carbon atoms, soluble in aqueous and organic short chain fatty alcohol; or 2) and modified by PEG with PEG modifier the same molecular weight or larger molecular weight. The invention provides a mobile phase additive relative to conventional additives, can effectively improve the sensitivity of the detection method, detection method can have pegylated protein could not be detected impurities, better control the quality of drugs.

【技术实现步骤摘要】
一种适用于聚乙二醇化蛋白质纯度检测的方法
本专利技术涉及一种适用于聚乙二醇化蛋白质的纯度检测方法，尤其是适用于聚乙二醇化药用蛋白酶的纯度检测，更具体的是一种聚乙二醇化门冬酰胺酶或激肽原酶的纯度检测方法。
技术介绍
药品的纯度与药物的理化及生物学性质息息相关，不仅会对药物的稳定性有影响，甚至与药品的药效、药代行为、安全性均有较大的关联。由此可见，杂质研究对于药品研发来说意义重大。《化学药物杂质研究的技术指导原则》中规定：任何影响药物纯度的物质统称为杂质。杂质的研究是药品开发的一项重要内容，杂质是否能被全面准确地加以控制，直接关系到药品的质量可控性和安全性，所以在药物的研究、生产、供应和临床使用等方面必须保证药物的纯度。规范地进行杂质的研究，并将其控制在一个安全、合理的限度范围之内，才能保证药物的有效和安全。中国药典中收载的一些常用的蛋白纯度检测方法缺乏普遍适用性，无法准确的对每种蛋白类药物进行纯度检测，尤其无法用于聚乙二醇化蛋白质的纯度检测。采用常规的SDS-PAGE方法来分析聚乙二醇化蛋白质的纯度(中国药典2005年版二部附录VF第五法SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法)存在诸多问题：1.操作繁琐，耗时较长。总体说来，SDS-PAGE需要经历制板->制分离胶->制浓缩胶->电泳槽安装->制样->加样->电泳->剥胶->染色->脱色->结果观察等十一个步骤；尽管可以购买商品化的电泳胶节省制胶的步骤和时间，但是依旧耗时较长，第一，样品的制备需要放入100℃加热5-10min；第二，电泳需要45min～1hr；第三，考马斯亮蓝染色、脱色同样需要1～2hr，并且需要多次更换脱色液。2.方法精密度较差，且具有一定的危险性。首先，若使用的是商品胶，方法的精密度取决于商品胶的生产质量；若为自制胶，则凝胶聚合受各种因素的影响，丙烯酰胺有毒性，能致癌致突变；TEMED易燃易挥发，有强神经毒性。3.方法灵敏度低，主成分与杂质分离度无法达到要求。聚乙二醇化蛋白质一般是蛋白质与一个以上的聚乙二醇通过共价结合而制得的。每一个蛋白质分子上都结合有一定数量的聚乙二醇。被聚乙二醇修饰后蛋白质受长链PEG水力学臂的影响，在电泳胶上呈弥散状态分别，根本无法准确考察聚乙二醇化蛋白质所产生的微量降解或聚集杂质。4.方法难以定量，目前除了灰度扫描外，并没有有效的手段通过SDS-PAGE电泳胶对目的蛋白进行定量分析；而灰度扫描也是通过色阶的差异进行分析，缺乏准确性及稳定性。高效液相色谱或超高效液相色谱为近年来逐渐广泛应用的蛋白质纯度分析方法，但是由于蛋白质经聚乙二醇化后性质发生改变，较难以通过常规色谱柱及色谱程序达到聚乙二醇化蛋白质及其相关杂质的分离。此外，申请人在研究中还发现，当以高效液相色谱或超高效液相色谱检测聚乙二醇化蛋白质的纯度时，普遍会存在检测结果中目的蛋白的色谱峰有严重拖尾的现象，无法有效并准确的检测出目的蛋白的纯度。如专利技术人用UPLC反相色谱法鉴定培门冬酶(聚乙二醇随机修饰门冬酰胺酶(L-ASP))的纯度时，培门冬酶的拖尾因子高达2.0；UPLC分子筛色谱法分析样品时，培门冬酶的拖尾仍然很严重，且无法通过常规手段如改变了流动相中的缓冲盐种类、盐浓度或者流动相pH值等方法改善培门冬酶在分子筛色谱法中的色谱行为。
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是：现有聚乙二醇化蛋白质纯度分析方法操作繁琐、精密度差、灵敏度低并具有一定的安全隐患；以及色谱法检测拖尾严重等的问题。本专利技术提供了一种分子筛色谱法检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，流动相中添加有：1)主链具有三个或三个以上碳原子、可溶于水相及有机相的短链脂肪醇；或2)与修饰用PEG具有相同分子量或者分子量更大的PEG修饰剂。上述醇类如正丁醇、异丙醇、3-甲基-1,3-丁二醇。上述PEG修饰剂优选与修饰用PEG具有相同分子量或者分子量更大的PEG修饰剂。如PEG随机修饰门冬酰胺酶所用PEG修饰剂为分子量5K的PEG修饰剂，流动相添加剂可选择分子量5K或大于5K(如40K)的PEG修饰剂。作为优选，流动相中含有2％～5％(V/V)异丙醇。作为优选，流动相是含2％～5％(V/V)异丙醇的20mmol/L磷酸盐缓冲液,pH6.0±0.5。作为优选，流动相流速为0.3mL/min。作为优选，色谱柱柱温25℃±5℃。所述聚乙二醇化蛋白质为聚乙二醇修饰的药用蛋白酶。作为优选，所述聚乙二醇化蛋白质为聚乙二醇随机或定点修饰的门冬酰胺酶、激肽原酶或精氨酸脱亚胺酶。作为优选，其中色谱柱选用填料为亚乙基桥杂化颗粒BEH。本专利技术的另一目的是，主链具有三个或三个以上碳原子、可溶于水相及有机相的短链脂肪醇或与修饰用PEG具有相同分子量或者分子量更大的PEG修饰剂在分子筛色谱法检测聚乙二醇修饰蛋白纯度时作为流动相添加剂的用途。上述物质可改善分子筛色谱法检测聚乙二醇修饰蛋白纯度时的色谱峰峰形，提高准确度。本专利技术开发的SEC-UPLC的分析方法，待检样品经适当稀释处理即可直接进样检测，操作简单，解决了现有方法操作繁琐的问题；本专利技术方法全程可以由仪器自动进样检测，通量较高，单针样品检测时间约为15min，解决了现有方法耗时长的问题；本专利技术方法仅受色谱方法条件中pH、温度、流速的影响，而这些条件可以通过仪器及溶液配制等操作进行准确控制，重复性及中间精密度均良好，解决了现有方法精密度差，受多种因素影响的问题。另一方面在本方法发现之前，专利技术人也尝试了多种色谱法对聚乙二醇化蛋白质进行纯度检测，如HPLC配合使用SEC柱、HPLC配合使用C4柱、UPLC配合使用C4柱等等，但始终未能使培门冬酶及其相关杂质达到分离，甚至未有任何分离的趋势。偶然的机会，专利技术人在流动相中混入了一些特定的醇，意外发现培门冬酶拖尾现象有很大的好转。同时，专利技术人也换用有机溶剂如甲醇、乙腈进行过相关的方法学考察，在含有此二种有机溶剂流动相条件下根本无法检出杂B；培门冬酶的拖尾因子严重，在甲醇的条件下甚至连杂A都无法检出，培门冬酶拖尾因子高达2.06。因此，本专利技术方法很好的解决了以色谱法检测聚乙二醇化蛋白质时拖尾严重的问题，能检出现有方法无法检出聚乙二醇化蛋白质中的杂质，更好地控制药品质量。附图说明图1：空白溶剂色谱图图2：系统适应性色谱图图3a：本公司研发的培门冬酶溶液(a)、自研培门冬酶对照品(b)、门冬酰胺酶蛋白(c)、国内首仿培门冬酶(d)、原研培门冬酶(e)用实施例1方法分析的色谱图图3b：图3a的局部放大图图4：不同程度降解的培门冬酶(样品1，样品2，样品3)用实施例1所述方法检测的液相色谱图图5:不同程度降解的培门冬酶用SDS-PAGE法检测图图6:方法验证中线性考察图谱(n＝3)。图7:流动相组分是否加异丙醇对比色谱图图8：流动相组分是否加盐对比色谱图图9:流动相加不同比例异丙醇对比色谱图图10:改变流动相pH值对比色谱图图11:改变柱温对比色谱图图12:改变流速的对比色谱图图13:实施例4方法1的系统适应性定位色谱图图14:实施例4方法1的培门冬酶与杂质A分离色谱图图15：实施例4方法2的色谱图图16：实施例4方法3以甲醇代替异丙醇的色谱图图17：实施例4方法4以乙腈代替异丙醇的色谱图图18：实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分子筛色谱法检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，流动相中添加有：1)主链具有三个或三个以上碳原子、可溶于水相及有机相的短链脂肪醇；或2)PEG修饰剂，所述PEG修饰剂的分子量不小于制备所述聚乙二醇修饰蛋白时所采用的PEG修饰剂。

【技术特征摘要】
2015.12.11 CN 20151091939071.一种分子筛色谱法检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，流动相中添加有：1)主链具有三个或三个以上碳原子、可溶于水相及有机相的短链脂肪醇；或2)PEG修饰剂，所述PEG修饰剂的分子量不小于制备所述聚乙二醇修饰蛋白时所采用的PEG修饰剂。2.权利要求1所述的检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，其特征在于所述醇类物质是正丁醇、异丙醇、3-甲基-1,3-丁二醇。3.权利要求1所述的检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，其特征在于所述流动相中含有2％～5％(V/V)异丙醇。4.权利要求1所述的检测聚乙二醇化蛋白质纯度的方法，其特征在于所述流动相是含2％～5％(V/V)异丙醇的20mmol/L磷酸盐缓冲液,pH6.0±0.5。5.权...

【专利技术属性】
技术研发人员：马永，颜莎，王俊，
申请(专利权)人：江苏众红生物工程创药研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32