一种后弹力层角膜内皮移植术用移植片及其液泡分离制备法制造技术

本发明专利技术公开了一种后弹力层角膜内皮移植术用移植片及其液泡分离制备法。本发明专利技术提供的移植片的制备方法，包括如下步骤：以猪角膜为原料，通过注射液体的方式在基质层和后弹力层之间形成整体大液泡，然后切割分离，得到由后弹力层和内皮细胞层组成的移植片。本发明专利技术以猪眼球为原料，制备了由后弹力层和内皮细胞层组成的移植片，期待能够有效缓解目前人角膜内皮供体极度匮乏的现状，为大量角膜盲患者带来复明的希望，具有重大的社会价值，并且具有非常大的产业化、商品化价值，投入临床市场后将带来可观的经济价值。

Graft for corneal endothelium transplantation of posterior elastic layer and preparation method of vacuole thereof

The present invention discloses a graft for a posterior elastic layer corneal endothelial graft and a method for preparing the vacuole thereof. Graft preparation method provided by the invention comprises the following steps: using porcine cornea as raw material, the large vacuoles formed between the stroma and Descemet membrane by injection of liquid, and then cutting, get graft by Descemet's membrane and endothelial cell layer. The invention uses porcine eyeball as raw material, graft by Descemet membrane and endothelial cell layer were prepared, expect to be able to effectively alleviate the current situation of donor corneal endothelium is extremely scarce, brings hope for a large number of cataract patients with corneal blindness, it has great social value, and has industrial and commercial value is very big the clinical market will bring considerable economic value.

【技术实现步骤摘要】
一种后弹力层角膜内皮移植术用移植片及其液泡分离制备法
本专利技术涉及一种后弹力层角膜内皮移植术用移植片及其液泡分离制备法，具体涉及一种用猪角膜制备的后弹力层角膜内皮移植术用移植片及其液泡分离制备法。
技术介绍
据统计，我国目前约有700000因严重角膜疾病而致盲的患者，角膜盲已经成为第二位可治疗性盲。角膜移植是患者复明的唯一手段。约50％的患者可以通过角膜内皮移植术(EndothelialKeratoplasty，EK)复明。作为最新的角膜内皮移植术，后弹力层角膜内皮移植术(DescemetMembraneEndothelialKeratoplasty，DMEK)具有诸多其他EK不具备的优势，因而临床应用前景广阔。但是，人角膜供体来源匮乏的现状严重制约了DMEK发展，因而寻找可以替代的生物活性材料成为必然。与传统穿透性角膜移植术(PenetratingKeratoplasty，PKP)将角膜全层移植给供体的方式不同，EK仅将供体角膜的内皮层移植给患者，这在很大程度上弥补了PKP一些不可避免的缺陷。EK方式地不断革新，使其临床应用前景愈加广阔，最新的DMEK更是以良好的术后视觉质量恢复、很轻的术后炎症反应、较低的免疫排斥率独具优势。DMEK要求的移植片仅包含后弹力层和角膜内皮层，具有厚度薄(约15μm)、脆弱易破、易卷曲等特性，因而将其完整从角膜基质层分离下来难度较大。另一方面，由于受传统观念的影响、法律法规的制约、公众捐献宣传教育工作的欠缺等，我国角膜供体来源极度匮乏的现状也严重制约了DMEK的发展，由于猪角膜来源广泛，物理和光学性质及内皮细胞形态与功能与人角膜相似，因而成为目前可替代人角膜内皮的最佳选择。角膜分为五层，由前向后依次为：上皮细胞层(Epithelium)、前弹力层(BowmanMembrane)、基质层(Stroma)、后弹力层(DescemetMembrane，DM)和内皮细胞层(Endothelium)。上皮细胞层厚约50μm，占整个角膜厚度的10％，由5-6层上皮细胞组成，角膜周边部分上皮细胞层增厚，细胞增加到8-10层。前弹力层为一层均质透明膜，无细胞成分，电镜观察显示主要由胶原纤维所构成。基质层由约200层与角膜表面平行的胶原纤维束薄板组成，厚约500μm，占整个角膜厚度的90％。后弹力层为较坚韧的透明均质膜，富于弹性，对化学物质和病理损害的抵抗力强。内皮细胞层为一层六角形扁平细胞构成，具有角膜-房水屏障功能。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种后弹力层角膜内皮移植术用移植片及其液泡分离制备法，具体涉及一种用猪角膜制备的后弹力层角膜内皮移植术用移植片及其液泡分离制备法。本专利技术提供了一种以猪角膜为材质的移植片的制备方法，包括如下步骤：(1)取离体的猪眼球，切取外边缘带有巩膜环的角膜；(2)取步骤(1)得到的角膜，去除小梁网，暴露出后弹力层止端；(3)用装有针头的注射器抽取液体，对完成步骤(2)的角膜进行注射，注射方式如下：①从后弹力层止端处针尖斜向内皮细胞层方向进针，针尖在基质层内潜行，(尽量)靠近后弹力层但不能破坏后弹力层；当针尖斜面完全进入基质层后开始注液，当液体进入基质层和后弹力层之间形成液泡时加快推注速度直至整体大液泡形成；如果前一步骤中，基质层中发生水肿未形成液泡，继续向前进针超过水肿区域，然后将针尖上挑并注液，当液体进入基质层和后弹力层之间形成液泡时加快推注速度直至整体大液泡形成，进针深度不应超过角膜横径的1/3；②如果步骤①没有得到基质层和后弹力层之间形成整体大液泡的角膜，选择与步骤①的进针位置相对位于其他象限的点作为进针位置，重复步骤①。③如果步骤②没有得到基质层和后弹力层之间形成整体大液泡的角膜，选择与步骤①和步骤②的进针位置相对位于其他象限的点作为进针位置，重复步骤①。④如果步骤③没有得到基质层和后弹力层之间形成整体大液泡的角膜，选择与步骤①和步骤②和步骤③的进针位置相对位于其他象限的点作为进针位置，重复步骤①；(4)完成步骤(3)后，取基质层和后弹力层之间形成整体大液泡的角膜，将液体抽出，切割剥离，得到由后弹力层和内皮细胞层组成的移植片。步骤(1)中，外边缘带有巩膜环的角膜中的巩膜为部分巩膜。步骤(1)中，外边缘带有巩膜环的角膜具体可为外边缘带有1-2毫米巩膜环的角膜。步骤(2)中，所述“去除小梁网”可为去除部分或全部小梁网，只要实现暴露出后弹力层止端即可。小梁网上附着有色素，因此去除小梁网的同时也去除了色素。步骤(2)中，可先进行台盼蓝染色，然后去除(具体可为刮除)小梁网。步骤(2)中，所述台盼蓝染色，可以对整个带有1-2毫米巩膜环的角膜进行台盼蓝染色，也可以在带有1-2毫米巩膜环的角膜的巩膜沟处进行台盼蓝染色。步骤(2)中还包括如下步骤：进行台盼蓝染色之后，刮除小梁网之前，用PBS缓冲液冲洗角膜。所述PBS缓冲液具体可为PBSpH7.4basic(1×)。步骤(3)中，所述液体为角膜保存液，具体可为OptisolGS。步骤(3)中，所述针头为弯曲角度为90-120°的弯曲针头。步骤(3)中，所述针头中，针孔位于针尖斜面上。步骤(3)中，所述装有针头的注射器具体可为针头与针筒为一体结构的注射器。步骤(3)中，所述装有针头的注射器具体可为规格为1ml的注射器。步骤(3)中，所述装有针头的注射器具体可为胰岛素注射器，例如舒锐TM一次性使用无菌胰岛素注射器。步骤(3)中，用装有针头的注射器抽取液体具体可为用装有针头的注射器抽取0.6ml-0.8ml液体。步骤(4)中，所述切割剥离的实现方式为：将角膜置于负压切割枕上，环钻切割，剥离。本专利技术还保护一种以猪角膜为材质的移植片的制备方法，包括如下步骤：(1)取离体的猪眼球，切取外边缘带有巩膜环的角膜；(2)取步骤(1)得到的角膜，去除小梁网，暴露出后弹力层止端；(3)完成步骤(2)后，分离后弹力层和内皮细胞层组成的膜，得到由后弹力层和内皮细胞层组成的猪DMEK移植片。步骤(1)中，外边缘带有巩膜环的角膜中的巩膜为部分巩膜。步骤(1)中，外边缘带有巩膜环的角膜具体可为外边缘带有1-2毫米巩膜环的角膜。步骤(2)中，所述“去除小梁网”可为去除部分或全部小梁网，只要实现暴露出后弹力层止端即可。小梁网上附着有色素，因此去除小梁网的同时也去除了色素。步骤(2)中，可先进行台盼蓝染色，然后去除(具体可为刮除)小梁网。本专利技术还保护一种以猪角膜为材质的移植片的制备方法，包括如下步骤：以猪角膜为原料，通过注射液体的方式在基质层和后弹力层之间形成整体大液泡，然后切割分离，得到由后弹力层和内皮细胞层组成的移植片。所述液体为角膜保存液，具体可为OptisolGS。所述切割剥离的实现方式为：将角膜置于负压切割枕上，环钻切割，剥离。以上任一所述的离体的猪眼球，约新鲜越好。以上任一所述方法制备得到的移植片也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还保护所述移植片在制备用于后弹力层角膜内皮移植术的产品中的应用。本专利技术还保护一种用于后弹力层角膜内皮移植术的产品，包括所述移植片。本专利技术还保护所述移植片作为后弹力层角膜内皮移植术的移植片的应用。本专利技术的专利技术人在大量试验摸索和验证的基础上，结合猪角膜自身的组织结构特点，提供了一套完整的移植片制备方法，以期用于人本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种移植片的制备方法，包括如下步骤：(1)取离体的猪眼球，切取外边缘带有巩膜环的角膜；(2)取步骤(1)得到的角膜，去除小梁网，暴露出后弹力层止端；(3)用装有针头的注射器抽取液体，对完成步骤(2)的角膜进行注射，注射方式如下：①从后弹力层止端处针尖斜向内皮细胞层方向进针，针尖在基质层内潜行，靠近后弹力层但不能破坏后弹力层；当针尖斜面完全进入基质层后开始注液，当液体进入基质层和后弹力层之间形成液泡时加快推注速度直至整体大液泡形成；如果前一步骤中，基质层中发生水肿未形成液泡，继续向前进针超过水肿区域，然后将针尖上挑并注液，当液体进入基质层和后弹力层之间形成液泡时加快推注速度直至整体大液泡形成，进针深度不应超过角膜横径的1/3；②如果步骤①没有得到基质层和后弹力层之间形成整体大液泡的角膜，选择与步骤①的进针位置相对位于其他象限的点作为进针位置，重复步骤①。③如果步骤②没有得到基质层和后弹力层之间形成整体大液泡的角膜，选择与步骤①和步骤②的进针位置相对位于其他象限的点作为进针位置，重复步骤①。④如果步骤③没有得到基质层和后弹力层之间形成整体大液泡的角膜，选择与步骤①和步骤②和步骤③的进针位置相对位于其他象限的点作为进针位置，重复步骤①；(4)完成步骤(3)后，取基质层和后弹力层之间形成整体大液泡的角膜，将液体抽出，切割剥离，得到由后弹力层和内皮细胞层组成的移植片。...

【技术特征摘要】
1.一种移植片的制备方法，包括如下步骤：(1)取离体的猪眼球，切取外边缘带有巩膜环的角膜；(2)取步骤(1)得到的角膜，去除小梁网，暴露出后弹力层止端；(3)用装有针头的注射器抽取液体，对完成步骤(2)的角膜进行注射，注射方式如下：①从后弹力层止端处针尖斜向内皮细胞层方向进针，针尖在基质层内潜行，靠近后弹力层但不能破坏后弹力层；当针尖斜面完全进入基质层后开始注液，当液体进入基质层和后弹力层之间形成液泡时加快推注速度直至整体大液泡形成；如果前一步骤中，基质层中发生水肿未形成液泡，继续向前进针超过水肿区域，然后将针尖上挑并注液，当液体进入基质层和后弹力层之间形成液泡时加快推注速度直至整体大液泡形成，进针深度不应超过角膜横径的1/3；②如果步骤①没有得到基质层和后弹力层之间形成整体大液泡的角膜，选择与步骤①的进针位置相对位于其他象限的点作为进针位置，重复步骤①。③如果步骤②没有得到基质层和后弹力层之间形成整体大液泡的角膜，选择与步骤①和步骤②的进针位置相对位于其他象限的点作为进针位置，重复步骤①。④如果步骤③没有得到基质层和后弹力层之间形成整体大液泡的角膜，选择与步骤①和步骤②和步骤③的进针位置相对位于其他象限的点作为进针位置，重复步骤①；(4)完成步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，潘志强，冯书堂，
申请(专利权)人：北京盖兰德生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11