一种I型神经纤维瘤病致病突变基因及基于此突变基因的病因学诊断试剂制造技术

本发明专利技术涉及一种I型神经纤维瘤病致病基因突变及基于此基因突变的病因学诊断试剂。本发明专利技术提供的神经纤维瘤病因学诊断试剂包括点突变分析试剂盒，所述试剂盒包括1)总RNA提取体系试剂盒：被测个体外周静脉血总RNA提取；2)RNA反转录及cDNA扩增体系试剂盒；3)cDNA测序体系试剂盒；所述cDNA测序体系试剂盒：对反转录获得的cDNA以SEQ ID NO.7‑16所示五个引物对进行PCR扩增，再对扩增得到的cDNA五个大片段以SEQ ID NO.17‑60所示引物对同时进行巢式PCR扩增和测序，并与原NF1基因编码DNA序列比对，当扩增产物中c.7106G>A，p.W2369X突变存在时为I型神经纤维瘤病患者。本发明专利技术的病因学诊断试剂省时、准确、且检测成本低。

【技术实现步骤摘要】
一种I型神经纤维瘤病致病基因突变及基于此基因突变的病因学诊断试剂
本专利技术涉及分子生物学及基因检测领域，尤其涉及一种I型神经纤维瘤病致病基因突变及基于此基因突变的病因学诊断试剂。
技术介绍
I型神经纤维瘤病(NeurofibromatosistypeI,NF1)由vonRecklinghausen于1882年首次报道，故又称为vonRecklinghausen病。I型神经纤维瘤病一般为常染色体显性遗传，部分为散发。临床上主要表现为皮肤咖啡斑、多发性皮肤软纤维瘤；非暴露部位(如腋窝、腹股沟)出现的雀斑和虹膜黑色素错构瘤；也可累及多个器官和系统，如眼、骨骼、血管、内分泌系统、中枢及外周神经系统等，并可伴有智力发育障碍、先天性发育不良、极罕见恶变者。该病由NF1基因发生突变引起。NF1基因定位于染色体17q11.2，包含57个组成性外显子和3个可变剪接外显子，全长283kb，有3个大小为11～13kb的成熟转录本，编码相对分子质量为327000、由2818个氨基酸组成的神经纤维(Neurofibromin)蛋白，大量表达于神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、肾上腺细胞、性腺细胞和白细胞。NF1基因是肿瘤抑制基因，不少研究表明NF1基因突变可通过干扰Ras循环的cAMP信号转导通路从而引发肿瘤。NF1基因自发突变率约为1/10000，是人类基因突变率最高的基因位点之一，约50％患者为新突变，至今仍有未明确的突变点，但发现了一些突变集中区域。其中外显子4b、7、10b、13、15、20、28，29，31可能为突变热点，而32号外显子突变可能是中国人NF1基因突变热点区域之一。目前发现的基因突变已超过700多种，包括碱基的转换、颠换、插入、缺失、移码突变、拼接突变及染色体平衡易位等。在这些突变中，约有82％突变造成神经纤维蛋白的截短，蛋白的截短对蛋白的功能结构产生重要的影响。目前，针对I型神经纤维瘤病高发病率检测的需求日益增加，设计研究科学合理且精准的检测试剂盒十分必要。由于NF1基因片段较大，突变情况复杂，易造成漏检。而该病不同患者的临床表现不同，且同一家族的不同患者临床表现也不同，大大增加了临床诊断的难度，因此建立快速且准确的诊断技术、攻克I型神经纤维瘤病的诊断难题，对其临床治疗和科学研究都具有重要的价值。但目前所发现的突变热点不足以解决临床上I型神经纤维瘤病基因筛查、诊断的难题。寻找新的致病突变，丰富NF1神经纤维瘤病突变谱，将为临床上方便快捷的筛查和诊断I型神经纤维瘤病患者提供重要的靶点及理论依据，这一直是本领域研究人员孜孜不倦的探究领域。由于NF1基因包含58个组成性外显子和3个可变剪接外显子，传统的针对每一个外显子的测序分析方法耗时长，每个测序样本完成检测一般需六、七天。而其他检测方法如NGS、FISH或MLPA等，需配备价格昂贵的大型仪器设备，实验条件要求高，导致检测成本大大升高。另外，NF1基因的突变类型除点突变外，还存在大片断缺失、一个或多个外显子的重复/缺失等多种类型。通过单一方法检测NF1基因突变易漏检，这也是目前NF1致病基因突变检测困扰临床遗传诊断人员的一个难题。综上所述，寻找对诊断有效的新致病突变，并研制省时、精准、且实验条件要求较低的诊断试剂对NF1基因突变全面检测，是解决I型神经纤维瘤病诊断难题的根本方法。
技术实现思路
有鉴于此，为攻克现有技术中的难题，本专利技术人经过艰辛研究，发现一种可有效诊断I型神经纤维瘤病致病基因的突变，并研制出基于此基因突变的病因学诊断试剂。该试剂可在短时间内获得诊断结果，实验条件要求低，诊断结果准确。本专利技术公开一种I型神经纤维瘤病致病基因突变，所述突变位于NF1基因第48号外显子区域，其编码第7106位的鸟嘌呤替换为腺嘌呤从而引起第2369位的色氨酸突变为终止密码子(c.7106G>A，p.W2369X)。本专利技术公开的I型神经纤维瘤病致病基因突变与I型神经纤维瘤病高度相关，该突变(c.7106G>A，p.W2369X)使神经纤维蛋白截短而失去正常功能，造成常染色体显性遗传病的I型神经纤维瘤病。本专利技术还提供基于上述I型神经纤维瘤病致病基因突变的神经纤维瘤病因学诊断试剂，所述诊断试剂包括点突变分析试剂盒，所述试剂盒包括1)总RNA提取体系试剂盒：被测个体外周静脉血总RNA提取；2)RNA反转录及cDNA扩增体系试剂盒；3)cDNA测序体系试剂盒；所述cDNA测序体系试剂盒：对反转录获得的cDNA以SEQIDNO.7-16所示五个引物对进行PCR扩增，再对扩增得到的cDNA五个大片段以SEQIDNO.17-60所示引物对同时进行巢式PCR扩增并测序，并与原NF1基因编码DNA序列比对，当扩增产物中c.7106G>A，p.W2369X突变存在时为I型神经纤维瘤病患者。进一步，所述诊断试剂还包括NF1基因外显子缺失分析试剂盒：以所述反转录获得的NF1基因cDNA为模板，以SEQIDNO.61-70所示引物对分别对NF1的外显子3、11、25、34、58进行实时荧光定量PCR扩增，以2-ΔΔCt法进行数据分析，计算得到五个外显子的相对基因含量，当五个外显子的相对基因含量均在0.5左右时为外显子缺失携带者，并提示NF1基因缺失或部分缺失。进一步，所述诊断试剂还包括NF1全基因大片段缺失分析试剂盒，所述试剂盒包括1)DNA提取体系试剂盒：被测个体外周静脉血基因组DNA提取；2)基因内微卫星多态标志分析试剂盒：以所述基因组DNA为模板，以SEQIDNO.1-6所示的三对引物对27AC28.4、27CAGT、38TG53.0三个多态性位点进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，当PCR产物中三个引物对扩增的片段均为纯合子时NFI基因存在全基因大片段缺失的可能性。进一步，所述对cDNA进行PCR扩增获得五个大片段时，引物退火温度为60℃；对五个大片段进行巢式PCR扩增时，引物退火温度为62℃。进一步，所述实时荧光定量PCR扩增合成引物片段不超过350bp。进一步，所述27CAGT扩增片段的大小为201bp左右，27AC28.4扩增片段的大小为214bp左右，38TG53.0扩增片段的大小为479bp左右。本专利技术还提供上述病因学诊断试剂的使用方法，包括如下步骤：1)以被测个体外周静脉血为样本，以所述点突变分析试剂盒分析样本中包括c.7106G>A，p.W2369X突变的点突变是否存在，如存在为I型神经纤维瘤病患者，如不存在进行下述步骤；2)以NF1全基因大片段缺失分析试剂盒分析样本中全基因大片段缺失存在的可能性，如存在杂合子，则排除全基因大片段缺失的可能性；如均为纯合子，则疑为全基因大片段缺失突变患者，进行下述步骤；3)以NF1基因外显子缺失分析试剂盒分析是否为外显子缺失携带者，如是缺失携带者则诊断为患者，如不是则为其他基因突变或正常个体。本专利技术还提供病因学诊断试剂中用于检测NF1基因突变的引物对组，包括用于检测NF1基因大片段缺失的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.1-6所示；用于扩增cDNA获得五个大片段的引物对，其核苷酸序列如SEQIDNO.7-16所示；用于对cDNA的五个大片段进行巢式PCR扩增的引物对，其核苷酸序列如SEQ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种I型神经纤维瘤病致病基因突变，其特征在于，所述突变位于NF1基因第48号外显子区域，其编码第7106位的鸟嘌呤替换为腺嘌呤从而引起第2369位的色氨酸突变为终止密码子(c.7106G>A，p.W2369X)。

【技术特征摘要】
1.一种I型神经纤维瘤病致病基因突变，其特征在于，所述突变位于NF1基因第48号外显子区域，其编码第7106位的鸟嘌呤替换为腺嘌呤从而引起第2369位的色氨酸突变为终止密码子(c.7106G>A，p.W2369X)。2.一种基于权利要求1所述致病基因突变的神经纤维瘤病因学诊断试剂，所述诊断试剂包括点突变分析试剂盒，所述试剂盒包括1)总RNA提取体系试剂盒：被测个体外周静脉血总RNA提取；2)RNA反转录及cDNA扩增体系试剂盒；3)cDNA测序体系试剂盒；其特征在于，所述cDNA测序体系试剂盒：对反转录获得的cDNA以SEQIDNO.7-16所示五个引物对进行PCR扩增，再对扩增得到的cDNA五个大片段以SEQIDNO.17-60所示引物对同时进行巢式PCR扩增和测序，并与原NF1基因编码DNA序列比对，当扩增产物中c.7106G>A，p.W2369X突变存在时为I型神经纤维瘤病患者。3.按照权利要求2所述的病因学诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂还包括NF1基因外显子缺失分析试剂盒：以所述反转录获得的NF1基因cDNA为模板，以SEQIDNO.61-70所示引物对分别对NF1的外显子3、11、25、34、58进行实时荧光定量PCR扩增，以2-ΔΔCt法进行数据分析，计算得到五个外显子的相对基因含量，当五个外显子的相对基因含量均在0.5左右时为外显子缺失携带者。4.按照权利要求3所述病因学诊断试剂，其特征在于，所述诊断试剂还包括NF1全基因大片段缺失分析试剂盒，所述试剂盒包括1)DNA提取体系试剂盒：被测个体外周静脉血基因组DNA提取；2)基因内微卫星多态标志分析试剂盒：以所述基因组DNA为模板，以SEQIDNO.1-6所示的三对引物对27AC28.4、27CAGT、38TG53.0三个多态性位点进行PCR扩增，聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR产物，当PCR产物中三个引物对扩增的片段均为纯合子时NFI基因存在全基因大片段缺失的可能性。5.按照权利要求2...

【专利技术属性】
技术研发人员：俞萍，
申请(专利权)人：杭州艾诺医学检验所有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33