一种微生物低温保存保护剂制造技术

本发明专利技术涉及一种微生物低温保存保护剂，及其制备方法和用途。微生物低温保存保护剂的成分为：非还原性糖、甘油、非离子型表面活性剂、钾盐、谷氨酸盐和水。本发明专利技术还建立了卡介菌低温长期保存的技术方法，为深入开展卡介菌的相关研究提供了技术支撑。

【技术实现步骤摘要】
一种微生物低温保存保护剂
本专利技术涉及一种微生物低温保存保护剂，及其制备方法和用途。
技术介绍
冷冻干燥是一种常用的实现微生物长保质期的方法(CarcobaR，2000)，被广泛视为是最适合的细菌脱水过程之一，其目的在于获得稳定的最终试剂(CarvalhoAS，2004)，也是用于贮存微生物细胞培养物的最常见方法之一。冷冻干燥后的细胞存活率反映了细胞抵抗快速冷冻和干燥的影响(Miyamoto‐ShinoharaY，2008)。一般认为，大多数无保护的细菌在冷冻干燥后都会被杀死，而存活的那些在进行贮存时迅速死亡。要想获得理想的冷冻及冻干效果，除工艺外，筛选和使用适宜的冷冻保护剂也是十分重要的。适宜的冻干保护剂能够使微生物在冻干以及解冻的过程中降低死亡率，减轻冷冻干燥以及解冻时所引起的菌体损伤。因而，冻干保护剂的种类、浓度和配置方法对微生物的保存效果有明显的影响。Harrison(1963)推荐冻干保护剂应具有以下条件：1)保护剂应含有能形成骨架的物质；2)它应含有限制剩余水分的缓冲物质；3)电解质的含量应少等。已进行了多种尝试来增加冻干和贮存后存活的细菌的数量，但仅取得有限的成功。选择适当的干燥介质/冷冻保护剂混合物是增加微生物尤其是细菌微生物在冻干和后续贮存过程中存活率的关键因素(CarvalhoAS，2004)。现有技术中，CN101108164A报告了卡介菌多糖核酸在冻干中的几项研究。Castro等人评估了5％的海藻糖对保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)在冷冻干燥后存活率的有益效果，相比起在单独的水中的约1％的留存率，它们显示25％的留存率。2003年，Carvalho等人证明了谷氨酸钠对冻干和3‐6个月的后续贮存期间的存活的稳定作用，但所报导的微生物存活率仍然很低。卡介菌(BacillusCalmette‐Guérin,BCG)源自具有致病性的牛型结核杆菌经230代次连续传代后形成的减毒菌株。我国目前涉及卡介菌的上市或临床研究中生物制品主要有皮内注射用卡介苗、卡介菌多糖核酸注射液(BCG‐PSN)、卡介菌纯蛋白衍生物(BCG‐PPD)、治疗用卡介苗、卡介菌CpG‐DNA等。这些产品均涉及卡介菌活菌的收获与应用，因此现行版药典均对其种子批传代代次有要求，目的是降低细菌变异的风险。尤其对于活菌制品的菌种传代代次要求基本为：自工作种子批启开至菌体收集，传代应不超过12代。然而国内卡介苗产品的代次多数为12代，国外卡介苗制品的代次则多为3‐5代，这种差别的主要原因是菌种首次复苏后活菌量少，只能通过增加培养代次来满足生产需要。解决该问题的首要关键之一是如何提高卡介菌菌种首次复苏的活菌含量。正常情况下，接种的活菌含量越多，菌种复苏所需的时间越短，形成的菌苔或菌膜的质量越高，反之，活菌含量越低，所需要的复苏时间就越长，进一步影响后续的传代与收获。卡介苗菌种所含的活菌数量与菌种的保存形式有关。菌种的保存形式有两种，一种为冻干保存，一种为液体冷冻保存。冻干菌种为卡介菌培养物加冻干保护剂后经过低温冷冻真空干燥制备而成，冻干后活菌较稳定，可在2‐8℃保藏与运输，在室温下也能保持相对稳定；但冻干后菌种活菌含量下降，平均仅为冻干前液体菌种的16％‐20％左右，且菌株经干燥后复苏时间也较长。菌种的另一种保存方式为液体冷冻保存菌种，即卡介菌新鲜培养物加低温保存保护剂后，在‐20℃及以下温度冷藏，该方式具有保持活菌含量高容易复苏的特点。目前，现有技术中对卡介菌的研究中，多针对卡介菌多糖核酸的保存进行研究，而对卡介菌活菌的菌种保存研究较少，同时，在菌种的保存中，基本都是采用冻干保存，存在冻干菌种复苏慢、保存效率不高等问题。为了克服现有技术中存在的缺点，本专利技术人通过长期的研究，专利技术了一种微生物低温保存保护剂，该保护剂可以有效的提高微生物的液体冷冻保存效率，尤其是能提高卡介菌活菌样品低温冷藏或冷冻后的活菌含量，进而提高卡介菌生产用活菌菌种首次复苏质量，解决现有技术中的上述问题，弥补了满足生产需要收获物传代代次多的缺陷。
技术实现思路
本专利技术提供了一种微生物低温保存保护剂，可以用于但不限于卡介菌菌种、卡介菌活菌样品等卡介菌活菌或其他细菌、微生物的低温冷藏，用以提高微生物，例如卡介菌生产用菌种，首次复苏质量，解决冻干菌种复苏慢等技术难题。为了最大限度地提高微生物，例如卡介菌生产用菌种，冷冻存活率，在低温保存前将低温保存保护剂添加到微生物培养物中。本专利技术涉及一种微生物低温保存保护剂，由非还原性糖、甘油、非离子型表面活性剂、钾盐、谷氨酸盐和水组成；其中，所述微生物低温保存保护剂各组分含量为1单位浓度含量；并且，1单位浓度含量中非还原性糖的量为4％到16％(w/v)，优选5％到15％(w/v)；甘油的量为0.9％到11％(v/v)，优选1％到10％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为0.4％到2.5％(v/v)，优选0.5％到2％(v/v)；钾盐的量为0.5％到2％(w/v)；所述谷氨酸盐的量为0.15％到1％(w/v)，优选0.2％到0.8％(w/v)。在本专利技术的一个实施例中，1单位浓度含量中非还原性糖的量为5％到15％(w/v)；甘油的量为1％到10％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为0.5％到2％(v/v)；钾盐的量为0.5％到1％(w/v)；所述谷氨酸盐的量为0.2％到0.4％(w/v)。在本专利技术的另一个实施例中，1单位浓度含量中非还原性糖的量为5％到15％(w/v)；甘油的量为1％到10％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为0.5％到2％(v/v)；钾盐的量为1％到2％(w/v)；所述谷氨酸盐的量为0.4％到0.8％(w/v)。在本专利技术的一个实施例中，还涉及一种微生物低温保存保护剂原液，其各组分含量为上述微生物低温保存保护剂的1单位浓度含量的倍数。优选的，微生物低温保存保护剂原液的各组分含量为1单位浓度含量的1.5倍～10倍，进一步优选为2倍～5倍，例如1.5倍、2倍、2.5倍或3倍等。在微生物低温保存保护剂原液的制备方面，本领域技术人员可以根据实际工作需要进行调整，如保存剂原液可以为1单位浓度的(包括但不限于)1倍、1.1倍、1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、2倍、2.1倍、2.2倍、2.3倍、2.4倍、2.5倍、2.6倍、2.7倍、2.8倍、2.9倍、3倍、3.1倍、3.2倍、3.3倍、3.4倍、3.5倍、3.6倍、3.7倍、3.8倍、3.9倍、4倍、4.1倍、4.2倍、4.3倍、4.4倍、4.5倍、4.6倍、4.7倍、4.8倍、4.9倍、5倍、5.1倍、5.2倍、5.3倍、5.4倍、5.5倍、5.6倍、5.7倍、5.8倍、5.9倍、6倍、6.1倍、6.2倍、6.3倍、6.4倍、6.5倍、6.6倍、6.7倍、6.8倍、6.9倍、7倍、7.1倍、7.2倍、7.3倍、7.4倍、7.5倍、7.6倍、7.7倍、7.8倍、7.9倍、8倍、8.1倍、8.2倍、8.3倍、8.4倍、8.5倍、8.6倍、8.7倍、8.8倍、8.9倍、9倍、9.1倍、9.2倍、9.3倍、9.4倍、9.5倍、9.6倍、9.7倍、9.8倍、9.9倍、10倍等。在使用时，本领域技术人员本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种微生物低温保存保护剂，其特征在于由非还原性糖、甘油、非离子型表面活性剂、钾盐、谷氨酸盐和水组成；其中，所述微生物低温保存保护剂各组分含量为1单位浓度含量；并且，所述1单位浓度含量中：非还原性糖的量为4％到16％(w/v)；甘油的量为0.9％到11％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为0.4％到2.5％(v/v)；钾盐的量为0.5％到2％(w/v)；谷氨酸盐的量为0.15％到1％(w/v)。优选的，非还原性糖的量为5％到15％(w/v)；甘油的量为1％到10％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为0.5％到2％(v/v)；钾盐的量为0.5％到2％(w/v)；谷氨酸盐的量为0.2％到0.8％(w/v)。

【技术特征摘要】
1.一种微生物低温保存保护剂，其特征在于由非还原性糖、甘油、非离子型表面活性剂、钾盐、谷氨酸盐和水组成；其中，所述微生物低温保存保护剂各组分含量为1单位浓度含量；并且，所述1单位浓度含量中：非还原性糖的量为4％到16％(w/v)；甘油的量为0.9％到11％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为0.4％到2.5％(v/v)；钾盐的量为0.5％到2％(w/v)；谷氨酸盐的量为0.15％到1％(w/v)。优选的，非还原性糖的量为5％到15％(w/v)；甘油的量为1％到10％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为0.5％到2％(v/v)；钾盐的量为0.5％到2％(w/v)；谷氨酸盐的量为0.2％到0.8％(w/v)。2.一种微生物低温保存保护剂原液，其特征在于所述微生物低温保存保护剂原液中非还原性糖、甘油、非离子型表面活性剂、钾盐和谷氨酸盐各组分含量为权利要求1所述的微生物低温保存保护剂的1单位浓度含量中各组分的倍数。优选的，微生物低温保存保护剂原液的各组分含量为权利要求1所述微生物低温保存保护剂的1单位浓度含量的1.5倍～10倍，进一步优选为2倍～5倍。更优选的，所述微生物低温保存保护剂原液中，非还原性糖的量为10％到30％(w/v)；甘油的量为2％到20％(v/v)；非离子型表面活性剂的量为1％到4％(v/v)；钾盐的量为1％到4％(w/v)；并且谷氨酸盐的量为0.4％到1.6％(w/v)。3.如权利要求1所述的微生物低温保存保护剂或权利要求2所述的微生物低温保存保护剂原液，其特征在于，其中：所述非还原性糖为海藻糖、棉籽糖或蔗糖；和/或所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯20，聚山梨酯40，聚山梨酯60和聚山梨酯80中的至少一种；和/或所述钾盐为硝酸钾、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、硫酸钾和氯化钾中的至少一种；和/或所述谷氨酸盐为谷氨酸钠。优选的：所述非还原性糖为海藻糖；和/或所述非离子型表面活性剂为聚山梨酯80；和/或所述钾盐为磷酸氢二钾和氯化钾中的至少一种；和/或所述谷氨酸盐为谷氨酸钠。4.如权利要求3所述的微生物低温保存保护剂或微生物低温保存保护剂原液，其特征在于每一百毫升1单位浓度中含有：海藻糖：4‐16g；甘油：0.9‐11mL；聚山梨酯80：0.4‐2.5mL；氯化钾或磷酸氢二钾：0.5‐2g；谷氨酸钠：0.15‐1g。优选的，海藻糖：5‐15g；甘油：1‐10mL；聚山梨酯80：0.5‐2.0mL；氯化钾或磷酸氢二钾：0.5‐2g；谷氨酸钠：0.2‐0.8g。5.如权利要求4所述的微生物低温保存保护剂或微生物低温保存保护剂原液，其特征在于，每一百毫升1单位浓度中含有海藻糖5‐15g，甘油9‐11mL，优选10mL，聚山梨酯800.4‐0.6mL，优选0.5mL，氯化钾或磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵爱华，王国治，付丽丽，寇丽杰，
申请(专利权)人：中国食品药品检定研究院，
类型：发明
国别省市：北京,11