蛋白质复性的方法技术

本发明专利技术涉及取代的咪唑鎓盐用于蛋白质复性、用于降低其聚集和／或用于增加其热稳定性的应用，以及用于蛋白质复性、用于降低其聚集和／或用于增加其热稳定性的方法，以及由根据本发明专利技术的方法制备的复性蛋白质。在根据本发明专利技术的方法中，使要处理的蛋白质与含有取代的咪唑鎓盐的液体复性基质接触。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及取代的咪唑鎓盐用于蛋白质复性、用于降低其聚集和/或用于增加其热稳定性的应用，以及用于蛋白质复性、用于降低其聚集和/或用于增加其热稳定性的方法，以及由根据本专利技术的方法制备的复性蛋白质。
技术介绍
在目前的情况下，蛋白质的复性可认为是生物学活性和/或高程度正确折叠的蛋白质的恢复或复原。蛋白质复性问题在生物技术中具有高度的重要性。由于在分子生物学的发展，可能以重组方式从蛋白质编码序列开始对其进行克隆并在宿主生物中产生所述的蛋白质。然而，在这些情形中，重组蛋白质常以生物学无活性的聚集体或包含体形式沉淀。在这些包含体中含有的蛋白质随后必须由体外复性转化为生物学活性形式。所述的复性是非常复杂的结构生物学过程，且常常仅导致非常低产量的天然蛋白质。因此，复性的蛋白质产量中即使少许百分比的增加也将提供基本的改善和经济利益。在包含体蛋白质的体外折叠中，已常观察到正确折叠和无效果的副反应如错折叠和聚集体之间的动力学竞争。聚集过程主要基于多肽链的疏水相互作用，所述的多肽链在很大程度上是未折叠或非天然的，部分地是折叠中间体。与其分子基础无关，这些聚集事件具有大于2的反应等级。随后，这些无效果的聚集反应的速率随未折叠的多肽链浓度的增加而增大。由于正确折叠事件主要由一级反应控制，所以这意味着如果变性的蛋白质浓度增加，那么聚集反应比正确折叠占优势。为此原因，体外折叠反应常常以非常低的蛋白质浓度进行。此外，物理参数如pH、离子强度、氧化还原系统和温度对于蛋白质复性必须是最适的。然而，在许多情形中，即使这些措施也未带来预期的成功率。此外，长期以来已知以非变性浓度加入缓冲液如尿素或胍盐可对折叠效率具有积极影响。作为胍盐或尿素的替代，其他离液序列高的物质也已用于体外折叠过程中，如烷基脲或共溶剂如羧酸酰胺或烷基化的胺。在来自大肠杆菌(E.coli)包含体的人类纤溶酶原激活物的复性情形中，已观察到体外折叠的产量可通过添加L-精氨酸而增强。进一步的研究已揭示L-精氨酸在其他蛋白质如抗体片段或免疫毒素的体外折叠中也可用于改善折叠效率。尽管精氨酸含有胍基，但它对结构的去稳定作用不如胍盐。因此，认为精氨酸可增加未折叠的多肽链或折叠中间体的溶解性，而不显著使天然蛋白质结构去稳定。增加体外这些效率的其他添加物为高度浓缩的Tris缓冲液、聚乙二醇或去污剂。也已用混合的微团(如Triton X 100和磷脂)实现了改善的折叠产量。所述的混合的微团含有可能通过与其相互作用而抑制折叠中间体聚集的极性和非极性基团。2000年5月的Amersham Pharmacia Biotech(Data FileAffinityChromatography；HiTrap Chelating 1ml和5ml；18-1134-78 AB)出版物中第1-6页描述了His6-标记的蛋白质在Ni2+-NTA柱上的复性。复性缓冲液含有20mM咪唑。所述的咪唑浓度可防止蛋白质和柱基质之间非特异性的相互作用，但不导致任何复性。相反，咪唑已知是一种变性剂。2000年Yeh等人的“细胞色素c的等级折叠(Hierachical folding ofcytochrome c)”(Nature Struct.Biol.7，第443-445页)描述了咪唑可加速细胞色素c的折叠动力学。蛋白质的His33与其共价结合的配体的分子内相互作用可由咪唑抑制。高浓度的咪唑基本具有对蛋白质的变性作用。尽管在文献中提到了许多用于蛋白质复性的规程，但该技术的工业应用不是非常充分发展的。该事实的原因基于技术和生物化学两者的困难。由于即使在最适的条件下，蛋白质的复性也仅在非常低的蛋白质浓度存在时才可实现，所以工业生产需要非常高的复性体积的操作。此外，即使在最适的条件下，许多蛋白质的复性效率也是低的。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目的是鉴定可在体外增强蛋白质折叠效率的物质，并提供一种以迄今为止获得的较高产量进行有效。该目的是根据本专利技术通过应用用于蛋白质复性、用于降低其聚集和/或用于增加其热稳定性的取代咪唑鎓盐实现的，以及是通过用于蛋白质复性、用于降低其聚集和/或用于增加其热稳定性的方法实现的，其中使要进行处理的蛋白质与含有取代咪唑鎓盐的液体基质接触。本专利技术也涉及应用根据本专利技术的方法制备的蛋白质。根据本专利技术的优选应用是用于蛋白质的复性。根据本专利技术，聚集的降低意指降低或甚至基本防止蛋白质的聚集，所述的蛋白质聚集通常在液体基质中延长的贮存期中发生并伴随着生物学功能性的丧失或减少。根据本专利技术，热稳定性的增加指即使在大大高于室温的温度时，生物学活性或正确的蛋白质折叠各自在延长的时间段中得以维持。根据本专利技术应用的咪唑鎓盐在室温时优选地是离子型液体。如果这些化合物在室温时不是液体，那么根据本专利技术的咪唑鎓盐在处理条件下至少应以液体形式存在和/或可溶于液体基质中。在本专利技术的背景中应用的咪唑鎓盐具有与环系统相关的有机成分的正电荷，所述的正电荷通常或优选地在咪唑鎓环中是离域的。本方法是基于令人惊讶的发现，即取代咪唑鎓盐抑制蛋白质的聚集并增强复性效率。迄今为止，这些有机盐仅已用作有机合成和两相催化作用中的溶剂，然而它们对生物化学中结构形成过程的作用迄今尚未知晓。也已描述了其他使得能够进行更有效的蛋白质复性的有机盐，如3-(1-吡啶并)-1-硫酸丙酯或盐酸胡芦巴碱(WO 99/18196)。这些物质例如在杂环系统中不具有离域的正电荷。在对它们对蛋白质的复性作用进行的直接比较中，本专利技术的咪唑鎓盐衍生物显示明显高的效率(也参见工作实施例以及图2和3连同图8和9)。优选地是本专利技术咪唑鎓盐的咪唑鎓环由烷基、烯基、芳基和/或芳烷基取代，而这些基团自身可由功能基团如含有氮、硫和/或磷的基团取代，其中不同的氧化状态是可能的。根据本专利技术的这些功能基团的优选例子为胺、羧基、羰基、醛、羟基、硫酸盐、磺酸盐和/或磷酸盐基团。根据本专利技术，咪唑鎓环的一个或两个N原子可由相同或不同的取代基取代。优选地，咪唑鎓环的两个氮原子均由相同或不同的取代基取代。根据本专利技术同样可能或优选的是咪唑鎓盐在咪唑鎓环的一个或多个碳原子进行加成性或排斥性取代。优选用作取代基的是C1-C4烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基和/或异丁基，特别优选的是乙基和/或甲基。同样优选的取代基为C2-C4烯基，如乙烯、正丙烯、异丙烯、正丁烯和/或异丁烯。具有这些C1-C4烷基和C2-C4烯基时，根据本专利技术的咪唑鎓盐化合物具有根据本专利技术特别有用的且随较长的烷基和烯基而降低的水溶性。然而，水溶性也可通过烷基或烯基链自身上的溶解促进取代基得到改善，如通过硫酸盐、磺酸盐、氨基或磷酸盐基团。根据本专利技术，也包含具有超过4个C原子的烷基和烯基取代基，如C5-C10烷基或烯基取代基也是优选的。这些C5-C10烷基或烯基如果在其烷基和/或烯基上具有一个或多个其他取代基，则进一步是优选的，所述的取代基如硫酸盐、磺酸盐、氨基或磷酸盐基团。至于芳基取代基，根据本专利技术优选的是单-和/或二环芳基、苯基、联苯和/或萘，以及这些化合物带有羟基、磺酸盐、硫酸盐、氨基、醛、羰基和/或羧基的衍生物。优选的芳基取代基的例子是酚、联苯、二酚、萘、萘羧酸、萘磺酸、二苯酚基、联苯羧酸、酚、苯基磺酸盐和/或苯酚磺酸。优选的芳烷基为苄本文档来自技高网...

【技术保护点】
取代的咪唑鎓盐用于蛋白质复性、用于增加其热稳定性和／或用于降低其聚集的应用。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：瑞奈尔鲁道夫，胡可李烈，吴塔雷武，
申请(专利权)人：塞尔蛋白质股份有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]