一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法技术

本发明专利技术提供一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法，属于生物技术领域。一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法，包括以属于葡萄座腔菌属的待检菌株DNA为模板，采用引物EF1‑S和EF1‑A进行PCR扩增的步骤；若扩增产物仅含有230‑250bp的DNA片段，则待检菌株为葡萄座腔菌；若扩增产物仅含有140‑160bp的DNA片段，则待检菌株为苹果壳色单隔孢溃疡病菌；若扩增产物仅含有170‑180bp的DNA片段，则待检菌株为钝葡萄座腔菌；所述引物EF1‑S和EF1‑A的序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。本发明专利技术鉴定方法，简便快捷、特异性高、通用性好。

【技术实现步骤摘要】
一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法
本专利技术涉及一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法，属于生物

技术介绍
葡萄座腔菌属（Botryosphaeria.Sp）中苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeriastevensii）、葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）和钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa）是苹果病害中三种重要的病原菌真菌。这三种病原真菌都可危害苹果、梨等果树的枝干和果实，在枝干、果实上形成溃疡、轮纹等症状，是世界上严重影响苹果生产的重要病原菌（Slippers&Wingfield2004；王璠等2013）。葡萄座腔菌属（Botryosphaeria.Sp）中苹果壳色单隔孢溃疡病菌（B.stevensii）为我国进境植物检疫性有害生物，寄主范围很广，除了苹果、梨以外，还可危害葡萄、橡树、榆树、枇杷等11个科，18个属的植物（VanNiekerketal.2004）。而对于该属病原菌的检测目前主要依靠病原菌的危害症状、菌落特征、病菌的无性型和有性型形态学特征，但是很难将它们进行区分而鉴定到种。
技术实现思路
为克服现有技术中存在的上述问题，本专利技术提供了一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法，简便快捷、特异性高、通用性好，能快速准确地鉴定出葡萄座腔菌属（Botryosphaeria.Sp）中三种重要的病原菌苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeriastevensii）、葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）和钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa），特别适用于出入境检验检疫对进出口苹果携带的此类病原真菌的快速鉴定。本专利技术的目的采用如下技术方案实现：一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法，包括以属于葡萄座腔菌属（Botryosphaeria.Sp）的待检菌株DNA为模板，采用引物EF1-S和EF1-A进行PCR扩增的步骤；若扩增产物仅含有230-250bp的DNA片段，则待检菌株为葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）；若扩增产物仅含有140-160bp的DNA片段，则待检菌株为苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeriastevensii）；若扩增产物仅含有170-180bp的DNA片段，则待检菌株为钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa）；所述引物EF1-S和EF1-A的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。在本专利技术中，所述PCR扩增体系含有2×TaqDNA聚合酶缓冲液12.5μL、引物EF1-S0.5μL、引物EF1-A0.5μL、待检菌株DNA1μL和无菌双蒸水10.5μL。在本专利技术中，所述PCR扩增程序如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，48℃复性30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸10min。在本专利技术中，以待检菌株的DNA为模板，采用ITS基因片段的通用引物ITS-F和ITS-R鉴别待检菌株是否属于葡萄座腔菌属（Botryosphaeria.Sp），所述引物ITS-F和ITS-R的序列分别如:SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。本专利技术以我国口岸截获的葡萄座腔菌属真菌为试验材料，将ITS和EF-1α两个基因共同作为葡萄座腔菌属（Botryosphaeria.Sp）中三种重要的病原菌苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeriastevensii）、葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）和钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa）的标准DNA条形码。首先，通过ITS通用引物鉴别病原菌属于葡萄座腔菌属（Botryosphaeria.Sp），然后通过针对EF-1α基因的特异性引物，鉴别病原菌是否为上述三种之一。本专利技术鉴定方法简便快捷、特异性高、通用性好，能快速准确地鉴定出是否为上述三种病原菌，特别适用于出入境检验检疫对进出口苹果携带的此类病原真菌的快速鉴定。附图说明图1是待检菌株的EF-1α基因扩增片段，其中泳道1-3为苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeriastevensii）的DNA扩增产物，泳道4-6为葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）的DNA扩增产物，泳道7-9为钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa）的DNA扩增产物。具体实施方式本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。在不背离专利技术构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本专利技术中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。1、特异性引物设计本专利技术以通过比较NCBI基因库中已有的葡萄座腔属真菌序列ITS、SSU、LSU、EF-1α，分别针对上述序列设计能够同时鉴别葡萄座腔菌属（Botryosphaeria.Sp）中三种重要的病原菌苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeriastevensii）、葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）和钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa）的多个引物。经过大量的筛选，发现在通过ITS通用引物鉴别为葡萄座腔菌属（Botryosphaeria.Sp）后，采用针对EF-1α基因的引物对EF1-S和EF1-A，可以鉴别样本是否为葡萄座腔菌属（Botryosphaeria.Sp）中的三种菌。特异引物EF1-S和EF1-A的序列如下：EF1-S（SEQIDNO:1）:5'-GCCACGACGGATCTCCTTGA-3’，EF1-A（SEQIDNO:2）:5'-AGATTGGCGGTATTGGCACG-3’。2.鉴别待检菌株是否为苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeriastevensii）、葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）和钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa）的具体方法以中国口岸截获的分离自苹果Apple的Botryosphaeria属真菌：苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeriastevensii）、葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）和钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa）为待检菌株。（1）DNA模板提取将待检菌株置于马铃薯葡萄糖琼脂（PotatoDextroseAgar;PDA）培养基上，25℃恒温培养3-5天，至真菌生长达到对数期后，挑取菌落进行DNA的抽提。真菌DNA抽提按照修正过的溴化十六烷三甲基铵（CetyltrimethylAmmoniumBromide；CTAB）方法进行。首先，刮取少量的PDA平板上生长的菌丝体，转移至2mL无菌离心管中。然后，在离心管中加入40μL10%(sodiumdodecylsulfate,sodiumsalt；SDS)十二烷基硫酸钠溶液及直径为0.5cm的小钢珠2个，用球磨仪（德国Retsch，莱驰MM400）以30次/秒频率震荡处理5-10min；加入600μL本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法，包括以属于葡萄座腔菌属（

【技术特征摘要】
1.一种鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学方法，包括以属于葡萄座腔菌属（Botryosphaeria.Sp）的待检菌株DNA为模板，采用引物EF1-S和EF1-A进行PCR扩增的步骤；若扩增产物仅含有230-250bp的DNA片段，则待检菌株为葡萄座腔菌（Botryosphaeriadothidea）；若扩增产物仅含有140-160bp的DNA片段，则待检菌株为苹果壳色单隔孢溃疡病菌（Botryosphaeriastevensii）；若扩增产物仅含有170-180bp的DNA片段，则待检菌株为钝葡萄座腔菌（Botryosphaeriaobtusa）；所述引物EF1-S和EF1-A的序列分别如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述鉴定苹果上三种葡萄座腔菌的分子生物学...

【专利技术属性】
技术研发人员：李彬，沈宏，李艳华，陈战，张宇，杨静，粟寒，吴翠萍，
申请(专利权)人：江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32