一种长度长达大约６００个氨基酸残基的重组嵌合体乙型肝炎核心（ＨＢｃ）蛋白分子，该分子 （ａ）含有一个ＨＢｃ序列，该序列具有ＨＢｃ分子Ｎ－末端１８３个氨基酸残基中的至少大约１２５个氨基酸残基，该序列包括从４号位到大约７５号位和从大约８５号位到大约１４０号位残基的ＨＢｃ序列，其中４８和１０７号位的两个半胱氨酸或其中之一被取代为另一种残基； （ｂ）任选地在该嵌合体的Ｎ－末端、大约７６到大约８５号位残基（在ＨＢｃ免疫优势环中）之间或Ｃ－末端三处中的一处或几处含有肽键结合的异源氨基酸残基序列，其中（ｉ）所述ＨＢｃ免疫优势环中一个序列的０到所有残基均存在或被取代，并通过肽键结合了所述异源氨基酸残基序列的１到大约２４５个氨基酸残基，这些残基构成免疫原，或者通过肽键结合了含有多达大约４０个残基的序列，这些残基则构成抗－抗原或用于偶联半抗原的化学反应性接头残基，或者（ｉｉ）７６－８５号位的ＨＢｃ序列存在并不具有缺失和异源残基，或者（ｉｉｉ）７６－８５号位残基中的一个或多个残基缺失或被取代， （ｃ）含有下述两种残基或其中的一种，即（ｉ）在一个不同于ＨＢｃ前核心序列的序列中的１－３个位于嵌合体分子中一种氨基酸位置上的半胱氨酸残基，所述氨基酸位置对应于ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示ＨＢｃ序列的Ｎ－末端开始的－２０到大约＋１号氨基酸位置［Ｎ－末端半胱氨酸残基］，和（ｉｉ）从ＨＢｃ序列Ｃ－末端残基到该分子Ｃ－末端的１－３个半胱氨酸残基，且这些半胱氨酸残基在该嵌合体分子Ｃ－末端开始的大约３０个残基内［Ｃ－末端半胱氨酸残基］； 该嵌合体分子（ｉ）在ＨＢｃ序列中含有多达大约２０％被取代的氨基酸残基，（ｉｉ）可自组装成颗粒，该颗粒在表达后基本上不结合核酸。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及免疫学和蛋白质工程领域的交叉部分，尤其涉及可作为免疫原应用在疫苗中的嵌合乙型肝炎病毒(HBV)核壳蛋白(HBc)，该HBc含有C末端半胱氨酸残基和/或N末端半胱氨酸残基，且存在于天然序列中HBc 48和107号位的两个半胱氨酸残基或其中之一被取代了。
技术介绍
嗜肝DNA病毒科是具有被膜、含DNA的动物病毒，可导致人类的乙型肝炎(HBV)。嗜肝DNA病毒科包括其它哺乳动物的乙型肝炎病毒，例如旱獭(WHV)和地松鼠(GSHV)，和出现在鸭(DHV)和灰苍鹭(HeHV)中的禽病毒。本文所说的乙型肝炎病毒(HBV)指嗜肝DNA病毒科中感染哺乳动物的一个成员，相对于感染禽类宿主的病毒，除非相关论述提及是特定的非哺乳动物病毒实例。根据病毒亚型，哺乳动物乙型肝炎病毒(HBV或嗜肝DNA病毒)的核壳或核心含有由183或185个氨基酸残基构成的序列，而鸭病毒衣壳含有262个氨基酸残基。若干种嗜肝DNA病毒的乙型肝炎核心蛋白单体可在受感染细胞中自组装成被称为乙型肝炎核心蛋白颗粒(HBc颗粒)的稳定聚集体。业已报导了HBc颗粒的两种三维结构。第一种结构包括含有二聚体形式的90个拷贝的HBc亚基蛋白或180个独立单体蛋白的小群体，第二种结构包括含有二聚体形式的120个拷贝的HBc亚基蛋白或240个独立单体蛋白的大群体。这些颗粒分别被称为T＝3或T＝4颗粒，其中“T”为三角划分数。这些人感染性病毒(人病毒)的HBc颗粒的直径分别为大约30或34nm。Pumpens et al.(1995)Intervirology，3863-74；和Metzger et al.(1998)J.Gen.Viol.，79587-590。Conway et al.，(1997)Nature，38691-94描述了分辩率为9埃的人HBc颗粒的结构。Bottcher et al.(1997)，Nature，38688-91描述了人HBc单体的多肽折叠，并提供了对形成了α螺旋区及其连接环区的氨基酸残基进行大致计数的方法。Zheng et al.(1992)，J.Biol.Chem.，267(13)9422-9429根据他们对缺乏一个或多个半胱氨酸的突变体蛋白的研究和其他人利用C-末端截短的蛋白质所进行的研究报导的是核心颗粒形成不取决于富含精氨酸的C-末端结构域、核酸的结合或二硫键的形成。业已公开的是乙型肝炎核壳或病毒核心蛋白(HBc)是一种免疫原性载体部分，可刺激免疫宿主动物的T细胞反应。例如，参见U.S.Patent No.4,818,527、No.4,882,145和No.5,143,726。这种载体尤为有用的应用是其在免疫优势环的特定位点呈递外源或异源B细胞表位的能力，该特定位点位于从该蛋白的氨基末端(N-末端)开始计算大约70-90号位的残基位置上，更常见的是被认为位于大约75-85号位。参见Clarke et al.(1991)在F.Brown等人编辑的Vaccines91，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NewYork中第313-318页中发表的论文。在病毒复制期间，HBV核壳与病毒RNA前基因组、病毒逆转录酶(Pol)和末端蛋白(来源于Pol)结合，形成复制感受态核心。核壳与病毒RNA前基因组的结合是由羧基末端(C-末端)富含精氨酸的结构域介导的。当在缺乏病毒RNA前基因组的大肠杆菌等异源表达系统中表达时，鱼精蛋白样C-末端，即150-183号位的残基可结合大肠杆菌RNA。Zhang et al.(1992)JBC，267(13)9422-9429。HBcAg是来源于乙型肝炎病毒的颗粒蛋白，已被提议作为异源表位的载体应用。业已比较了HBsAg(HBs)和HBcAg(HBc)二者的相对免疫原性，以及二者在不同的遗传背景中诱发免疫反应的能力。这些资料着重于HBc具有的比HBs高的免疫原性，以及HBc的通用反应性，而没有考虑遗传背景。例如，在BALB/c小鼠体内，HBc的免疫原性比HBs高300倍以上；虽然B10.S和B10.M小鼠均是HBs的无反应者，但被测试的各品系均对HBc具有反应性。这些结果再次强调了HBc作为疫苗载体的适用性，具体而言，是其对HBs的优势，因此选择了HBc，而不是HBs，用于负载异源表位。HBc载体的另一个优势在于其发挥效能时可能无需有效佐剂的事实。这是该颗粒固有的高免疫原性造成的。对HBc-贝氏疟原虫颗粒的免疫原性所作的比较显示，被批准用于人类的明矾比IFA或CFA更有效。该观测结果的重要性因为最近在SKB候选疟疾疫苗的临床实验中被注意到的与更新、更复杂佐剂相关的毒性难题而得以突出。在作为疫苗载体部分的应用中，优选的是HBV核壳不结合宿主来源的核酸。Birnbaum et al.(1990)J.Virol.，643319-3330指出HBV核壳的鱼精蛋白样C-末端结构域可以缺失，而不影响该蛋白组装成病毒样颗粒的能力。因此，有报导指出，被截短至大约144号位，即含有从1到大约144号位的HBc序列的蛋白质可以自组装，而发生在139号位残基之外的缺失将破坏衣壳组装。Zlotnick et al.，(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，949556-9561研究了全长和被截短的HBc蛋白组装成颗粒的情况。除讨论全长分子外，上述作者还报导了截短蛋白的制备，该截短蛋白具有1-149号位的HBc序列，其中48、61和107号位的半胱氨酸均被丙氨酸取代，且C-末端(150号位)添加了一个半胱氨酸残基。C-末端硫醇被用于连接金原子团，以便在电子显微镜术中进行标记。最近，Metzger et al.(1998)J.Gen.Viol.，79587-590报导，人病毒序列138号位的脯氨酸(Pro-138或P138)是颗粒形成所必需的。这些作者还报导，羧基末端被截短至142和140个残基长度的颗粒的组装能力受到了影响，当被截短至139和137个残基长度时，组装能力完全丧失。若干个研究小组已指出，与标准乙型肝炎核心颗粒相比，截短的颗粒表现为稳定性降低了，体现在颗粒尺寸的变化和纯化制剂中存在的颗粒片段。因此，在上述Metzger等人的报导之前，Pumpens et al.，(1995)，Intervirology，3863-74已对相关文献报导进行了综述，指出自组装所必需的HBc序列的羧基末端边界位于139和144号位的氨基酸残基之间，且前2或3个氨基末端残基可被其它序列取代，但剔除4或11个氨基末端残基将导致嵌合蛋白在转化的大肠杆菌细胞中完全消失。具有多种多肽序列的内在插入片段的重组生产的杂合HBc颗粒(在本领域中被称为HBc嵌合颗粒或HBc嵌合体)，是通过在广泛多种生物，包括大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、牛痘、鼠伤寒沙门氏菌、酿酒酵母中的异源表达而制备的，例如，参见Pumpens et al.(1995)Intervirology，3863-74，及其引用文献，其中指出了若干个研究小组的工作。通过电子显微镜术分析时发现，与缺乏异源表位的颗粒相比，这种HBc嵌合体通常表现为具有较差的有序结构。在某些情况中，将异源表位插入C-末端截本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：K·莱昂斯，A·J·伯克特，J·A·哈伦，
申请(专利权)人：洛伦蒂斯有限公司，
类型：发明
国别省市：
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