EGLN2变体及其在预防或治疗血栓栓塞病和冠心病中的用途制造技术

本发明专利技术涉及在氨基酸序列的５８位具有丝氨酸或亮氨酸的人ＥＧＬＮ２变体及其在预防或治疗血栓栓塞病或冠心病中的用途，其中所述疾病尤其是中风、长期的可逆性局部缺血性神经功能缺损（ＰＲＩＮＤ）、短暂性局部缺血发作（ＴＩＡ）、心肌梗塞和／或早发性心肌梗塞。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及在氨基酸序列的58位具有丝氨酸或亮氨酸的人EGLN2变 体及其在预防或治疗血栓栓塞病或冠心病中的用途，其中所述疾病尤其是 中风、长期的可逆性局部缺血性神经功能缺损(prolonged reversible ischaemic neurological deficit; PRIND )、短暂性局部缺血发作(transient ischemic attack; TIA)、心肌梗塞和/或早发性心肌梗塞(premature myocardial infarct),
技术介绍
EGLN2，由于其的HIF脯氨酰羟化酶活性，也称作含有脯氨酰羟化酶 结构域的蛋白质1 (PHD1 )，其属于具有由5个编码外显子组成的保守基 因组结构的1gl-^ine基因家族的 一 组密切相关蛋白质。HIF (hypoxia-inducible factor,缺氧诱导因子)是在氧稳态的许多方面发挥关 键作用的转录调节因子，但EGLN同种型EGLN1(PHD1)、 EGLN2(PHD2) 和EGLN3(PHD3)在HIF的生理调节上所起的作用仍然不明确(Appelhoff， R. J.等人(2004) J. Biol. Chem., 279, 38458-38465, No. 37 )。已报道，所有 EGLN同种型都表现出不同的细胞特异性和可诱导性行为，这使得可以灵 活地调节HIF对缺氧的反应。这意p未着，对特定EGLN同种型的特异药 理学抑制作用可能可以选择性地调节HIF反应，这在治疗应用中将是有用 的(Appelhoff， R. J.等人(2004)，见上文)。例如，对EGLN2的抑制作用 广泛地在一系列处于静息状态的细胞类型中激活HIF反应。相反，对 EGLN3的特异抑制作用选择性地在高水平表达该酶的一些组织中增强对 缺氧的反应(Appelhoff, R. J.等人(2004)，见上文)。这开启了治疗局部缺 血性/缺氧性疾病的可能性。与EGLN2和EGLN3相反地，对EGLN1的生理作用知道得不多。
技术实现思路
为了更好地理解EGLN2在冠心病发生和发展中的潜在作用，就 EGLN2基因在根据本专利技术以索引号NM一053046.2发表的EGLN2参考序 列的470位的变异，对一组详细表征的患者进行了基因型-表型相关性分 析，其中所述变异为。已经已知SNP (单核苷酸多态性)形式的EGLN2基 因的不同遗传变体，并发表在httD:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP/snp ref,cgi locusId=112398)。令人惊讶地发现，编码人EGLN2蛋白质的核酸在470位核苷酸的变 异、尤其是从胞嘧咬变为胸腺嘧啶、或者人EGLN2蛋白质在58位氨基酸 的变异、尤其是从丝氨酸变为亮氨酸，与血松栓塞病和/或冠心病的发生相 关。因此，本专利技术的一个主题涉及含有根据SEQ ID NO: 3的^J^絲列 的EGLN2蛋白质和编码该EGLN2蛋白质的核酸，尤其是根据SEQ ID NO: 4的核酸序列。优选地，根据本专利技术的核酸为DNA或RNA,优选DNA， 尤其是双链DNA。该核酸的序列可以进一步表征为其具有至少 一个内含子 和/或一个polyA序列。在本专利技术再一实施方案中，核酸可以用来制备栽体，优选穿梭载体、 噬菌粒、粘粒、表达载体或具有基因治疗活性的载体形式。此外，基因敲 除构建体或表达盒可以用上述核酸制备。表达载体可以为原核或真核表达 栽体。原核表达载体的实例为例如用于在大肠杆菌(E.coli)中表达的载体， 例如载体pGEM或pUC衍生物，真核表达载体的实例为用于在酿酒酵母 (Saccharomyccs ccrcvisiac )中表达的载体，例如载体p426Met25或 p426GALl (Mumberg等人(1994) Nucl. Acids Res.， 22， 5767-5768)，用于 在昆虫细胞中表达的载体，例如EP-B1-0 127 839或EP-B1-0 549 721中公 开的杆状病毒(Baculovirus)载体，以及用于在哺乳动物中表达的载体，例 如载体Rc/CMV和Rc/RSV或SV40载体，其中所述栽体都为通常能获得的。 一般而言，表达载体也含有适于相应宿主细胞的启动子，例如在大肠杆菌中表达的trp启动子(见，例如EP-B1-0 154 133)，在酵母中表达的 Met25、 GAL1或ADH2启动子(Russel等人(1983)， J. Biol. Chem. 258， 2674-2682; Mumberg,见上文)，在昆虫细胞中表达的杆状病毒多角体蛋白 启动子(见，例如EP-B1-0 127 839)。对于在哺乳动物细胞中的表达，例如， 适宜的启动子为那些允许在真核细胞中组成性、可调节性、组织特异性或 代谢特异性表达的启动子。'根据本专利技术的可调节元件为启动子、激活物序 列、增强子、沉默子和/或阻抑物序列。使得可以在真核生物中组成性表达 的合适可调节元件的实例为RNA聚合酶III识别的启动子或病毒启动子、 CMV增强子、CMV启动子(也见实施例13)、 SV40启动子或例如来自 MMTV(小鼠乳腺瘤病毒；Lee等人(1981) Nature 214， 228-232)的LTR启 动子，以及衍生自例如HBV、 HCV、 HSV、 HPV、 EBV、 HTLV或HIV 的其它病毒启动子和激活物序列。使得可以在真核生物中诱导性表达的可 调节元件的实例为与相应阻抑物联合的四环素操纵基因(Gossen M.等人 (1994) Curr. Opin. Biotechnol. 5， 516-20)。使得可以在真核生物中代谢特异 性表达的可调节元件的实例为优选受缺氧调节的启动子。为了能够引入根据本专利技术使用的核酸、并且由此能通过转染、转化或 感染而在真核细胞或原核细胞中表达多肽，核酸可以以质粒形式或者作为 病毒或非病毒栽体的一部分出现。本文适宜的病毒载体尤其为杆状病毒、 痘苗病毒、腺病毒、4^目关病毒(adeno-associated viruse)和疱渗病毒。 本文适宜的非病毒栽体尤其为病毒体、脂质体、阳离子脂质或多聚赖氨 酸缀合的DNA。具基因治疗活性的载体的实例为病毒载体，例如腺病毒载体或逆转录 病毒载体(Lindemann等人，1997， Mol. Med. 3: 466-76; Springer等人，1998 Mol. Cell. 2: 549-58)。分离形式的真核表达载体对基因治疗用途是合适的， 因为棵露的DNA在局部应用时能够渗透进入皮肤细胞(Hengge等人，1996， J. Clin. Invest. 97: 2911-6; Yu等人，1999， J. Invest. Dermatol. 112: 370-5)。 具基因治疗活性的栽体也可以通过将才艮据本专利技术所用的核酸和脂质体复来获得，因为这样能实现非常高的转染效率，尤其是对皮肤细胞(Alexander 和Akhurst， 1995， Hum. Mol. Genet. 4: 2279-85)。在脂质转染的情况中，可 以通过超声波处理脂质体悬浮液，从阳离子脂质制备单层小脂泡。DNA以 离子方式结合至脂质体表面，其中结合比率使得可以本文档来自技高网...

【技术保护点】
ＥＧＬＮ２蛋白质，其含有根据ＳＥＱ　　ＩＤ　　ＮＯ：３的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D科齐安，M赫尔曼，
申请(专利权)人：塞诺菲安万特股份有限公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]