基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法技术

本发明专利技术公开了一种基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法，所述基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法利用质谱数据依赖性和全信息串联采集；将质谱DDA采集获得的数据用Peaks软件进行从头测序后，再用MS

Sequencing method for realizing amino acid sequence of monoclonal antibody medicament based on mass spectrometry technology

The invention discloses a method for sequencing monoclonal antibody drug amino acid sequence of mass spectrometry based on the sequencing method of monoclonal antibody drugs amino acid sequence of mass spectrometry using mass spectrometry data dependence and full information acquisition based on the tandem mass spectrometry DDA; will the collected data using Peaks software for de novo sequencing, and then MS

【技术实现步骤摘要】
基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法
本专利技术属于氨基酸测序
，尤其涉及一种基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法。
技术介绍
目前，抗体药物是近年来生物制药领域增长率最快的一类生物技术药物，以靶向性强、副作用小等优势在癌症、自身免疫性疾病等领域应用广泛。目前，单抗药物占据了全球十大畅销药物的半壁江山。在中国，单抗药物的申报和销售也呈急速上升趋势，随着原研产品专利过期，有越来越多的企业投身于单抗生物类似药的研发和生产。因单抗药物存在巨大的经济利益，不少不法分子制造生产单抗假药，严重危害国民的健康。因此，对单抗药物的质量研究刻不容缓。氨基酸序列是单抗药物的一级结构，是单抗药物研究的基础。但是由于专利保护等原因，在专利期内的单抗药物氨基酸序列较难获得，成为研发瓶颈。基于软电离技术的开发，质谱成为蛋白质药物研究的重要手段。在单抗药物氨基酸序列的鉴定和确证中，首先用胰蛋白酶等进行酶解，获得肽段用质谱进行一级扫描和二级碎裂。得到的数据与已知的单抗药物氨基酸序列进行匹配以获得鉴定结果。再通过完整蛋白和轻重链的理论与测定分子量的一致性比较进一步确证单抗的氨基酸序列。当无法获得氨基酸序列时，可以通过文献检索等方法初步获得。但由于自我保护等原因，文章中公布的氨基酸序列通常与真实序列存在较大差异，需要进一步验证和研究。质谱数据采集的方法包含有数据依赖性(DDA)、全信息串联(MSE)采集等。数据依赖性采集(DDA)利用一级全扫描检测肽段母离子，然后按信号强度排列，将前若干位的母离子依次选择、碎裂，并扫描二级碎片离子。由于DDA通常选择一级扫描中信号最强的1～10个母离子进行碎裂，因此二级碎裂图谱的质量较高。对于准确解析肽段的氨基酸序列非常有力。但DDA也存在一定的局限性先强后弱的采集方式易造成低丰度肽段信息丢失。全信息串联(MSE)指从液相色谱流出的所有肽段峰以及每个肽段的各个价态都会进行碎裂，并同时采集一级质谱数据。MSE能够给出更全面的信息，所有的离子信息都被记录，定量、定性更加准确。但由于肽段的丰度差异比较大，而图谱的信号动态范围有限，有些碎裂谱图不是特别理想。不同数据采集方式获得的数据需要不同的软件进行数据分析。DDA可采用PepFinder等，而MSE可采用UNIFI，Biopharmalynx等。质谱denovo测序是一种直接解释串联质谱数据的方法。每个串联质谱峰对应一对肽键的裂解，通过确定质谱中峰的离子类型可以得到这个峰对应肽段的前缀或后缀子序列的质量。理论上，可以根据串联质谱中信号强度高的碎片离子之间的质量差和母离子信号确定离子类型，得到相应的b离子、y离子或其他离子峰。然后通过计算相邻的同类型碎片离子之间的质量差获得肽段的全长序列。为了更准确地分析氨基酸序列，denovo测序对质谱一级、二级谱图的质量偏差、碎片离子的数量、丰度均有较高的要求。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法，旨在解决现有的氨基酸序列不公开或公布的氨基酸序列通常与真实序列存在较大差异，测序中数据采集方式易造成低丰度肽段信息丢失，对质谱一级、二级谱图的质量偏差、碎片离子的数量、丰度均有较高要求的问题。本专利技术是这样实现的，一种基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法，所述基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法利用质谱数据依赖性和全信息串联采集相结合；将质谱DDA采集获得的数据用Peaks软件进行从头测序后，再用MSE采集获得的数据进行氨基酸序列的验证。进一步，所述基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法包括以下步骤：步骤一，文献检索，在Pubmed输入需要解析单抗药物的名称、研发企业或结合抗原等特征词进行查找，找到与氨基酸序列研究相关的文献，获得该单抗IgG类型，CDR区、恒定区、可变区序列信息；步骤二，采用胰蛋白酶进行酶解；具体条件及过程为：1.取单抗原液100μL(10mg/mL)，加水稀释至样品浓度为5mg/mL。2.计算稀释体积，使得样品终体积为1ml，终浓度为1mg/mL，用7M盐酸胍、250mMTris、1mMEDTA(pH＝7.5)的蛋白变性缓冲液稀释。3.加入10μL1M二硫苏糖醇(DTT)到稀释后样品中，在37℃孵育1小时，使蛋白还原。4.加入12μL2.9M碘乙酰胺(IAA)到还原后的样品中，在室温下暗室反应40分钟，使蛋白烷基化。然后加入30μL1MDTT到烷基化后样品中，终止反应。5.用10mL100mMTris(pH＝7.5)酶解缓冲液，平衡NAP-5柱子，每次加入0.5mL，重复加入20次。6.加入500μL还原烷基化后的样品到平衡后的NAP-5柱子中，每个样品使用两个NAP-5柱子，弃去流出的馏分。7.对于每个NAP-5柱子，用800μL酶解缓冲液洗脱，并收集洗脱液。8.根据样品浓度，加入胰蛋白酶，蛋白：酶＝1:20，37℃孵育1.5小时，使蛋白酶解成肽段。9.将酶解后样品进行冷冻干燥，然后用100μL水重新溶解，加入进样小瓶。再通过DDA数据采集获得高质量一级谱图和二级谱图。具体数据采集方法为1色谱条件:色谱柱:ACQUITYUPLCBEH130C18(1.7μm，2.1mm×150mm)；流动相:A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.09％三氟乙酸90％乙腈溶液；梯度洗脱；2-47分钟B相从1-40％，流速为0.3mL/min，柱温65℃。2质谱条件:采用正离子模式，喷雾电压为4.0kV；离子传输管温度为325℃；S-lens为60％。扫描模式为DDA,选择一级谱图中相对强度最高的3个离子去做二级碎裂；一级扫描为Orbitrap；扫描范围为m/z200-2000；分辨率为60K；碰撞模式为CID；碰撞能量为35％；二级扫描为离子阱；扫描速度为Normal。将一级、二级谱图用Peaks软件进行denovo解析，获得初步的氨基酸序列结果。具体方法为采用SwissProt人数据库(20197条序列)和添加的该单抗蛋白氨基酸序列合并后进行蛋白质鉴定。鉴定采用PeaksStudio8.0软件，设置参数如下：酶解方式为胰蛋白酶；质量容差一级为7ppm；二级为0.05Da；固定修饰包括：还原烷基化：半胱氨酸+57Da；可变修饰:氧化甲硫氨酸+16Da，脱酰胺化天冬酰胺、谷氨酰胺+0.98Da；结果质控方式：谱图水平1％假阳性率。差异比较采用PEAKSQ非标记定量算法，基于一级谱峰峰面积强度进行肽段定量并整合为蛋白质的差异信息，归一化对添加单抗蛋白强度计算后以此归一化，结果取倍数变化大于2倍结果进行差异蛋白选取。步骤三，采用多种蛋白酶进行酶解，包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C、Lys-C、以及为了鉴定到N-糖基化位点而进行的PNGaseF酶串联胰蛋白酶切。糜蛋白酶具体条件与过程与胰蛋白酶基本一致，只是在酶反应时间上略有区别。糜蛋白酶，蛋白：酶＝1:20，37℃孵育16-18小时。Glu-C和Lys-C酶解，1-4步骤与胰蛋白酶酶解步骤一致。5.用10mL水，平衡NAP-5柱子，每次加入0.5mL，重复加入20次。6.加入还原烷基化后的样品到平衡后的NAP-5柱子中，弃去流出的馏分。7.用800本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法，其特征在于，所述基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法利用质谱数据依赖性和全信息串联采集；将质谱DDA采集获得的数据用Peaks软件进行从头测序后，再用MS

【技术特征摘要】
1.一种基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法，其特征在于，所述基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法利用质谱数据依赖性和全信息串联采集；将质谱DDA采集获得的数据用Peaks软件进行从头测序后，再用MSE采集获得的数据进行氨基酸序列的验证。2.如权利要求1所述的基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法，其特征在于，所述基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法包括以下步骤：步骤一，通过文献检索获得该单抗IgG类型，CDR区、恒定区、可变区序列信息；步骤二，采用胰蛋白酶进行酶解，再通过DDA数据采集获得高质量一级谱图和二级谱图，将一级、二级谱图用Peaks软件进行denovo解析，获得初步的氨基酸序列结果；步骤三，采用多种蛋白酶进行酶解，MSE采集数据后可获得所有肽段峰以及每个肽段的各个价态完整和碎裂的信息；步骤四，将获得的更加全面的质谱数据与初步的氨基酸序列进行匹配，实现氨基酸序列验证。3.如权利要求2所述的基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法，其特征在于，采用DDA模式进行肽段的色谱分离和质谱数据的采集，采用PepFinder分析处理数据，用已有的氨基酸序列进行匹配；利用Peaks软件对DDA质谱数据进行从头测序的软件分析。4.如权利要求2所述的基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法，其特征在于，进一步包括：采用多种蛋白酶分别酶解该单抗，包括胰蛋白酶、糜蛋白酶、Glu-C、Lys-C、以及PNGaseF酶串联胰蛋白酶切；采用MSE模式采集肽段以及UNIFI处理数据去验证denovo后的结果。5.如权利要求2所述的基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法，其特征在于，所述酶解的具体条件及过程为：取单抗原液100μL，加水稀释至样品浓度为5mg/mL；计算稀释体积，使得样品终体积为1ml，终浓度为1mg/mL，用7M盐酸胍、250mMTris、1mMEDTApH＝7.5的蛋白变性缓冲液稀释；加入10μL1M二硫苏糖醇到稀释后样品中，在37℃孵育1小时，使蛋白还原；加入12μL2.9M碘乙酰胺到还原后的样品中，在室温下暗室反应40分钟，使蛋白烷基化，然后加入30μL1MDTT到烷基化后样品中，终止反应；用10mL100mMTrispH＝7.5酶解缓冲液，平衡NAP-5柱子，每次加入0.5mL，重复加入20次；加入500μL还原烷基化后的样品到平衡后的NAP-5柱子中，每个样品使用两个NAP-5柱子，弃去流出的馏分；对于每个NAP-5柱子，用800μL酶解缓冲液洗脱，并收集洗脱液；根据样品浓度，加入胰蛋白酶，蛋白：酶＝1:20，37℃孵育1.5小时，使蛋白酶解成肽段；将酶解后样品进行冷冻干燥，然后用100μL水重新溶解，加入进样小瓶。6.如权利要求2所述的基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法，其特征在于，所述再通过DDA数据采集获得高质量一级谱图和二级谱图具体数据采集方法为：色谱条件:色谱柱:ACQUITYUPLCBEH130C18；流动相:A相为0.1％三氟乙酸水溶液，B相为0.09％三氟乙酸90％乙腈溶液；梯度洗脱；2-47分钟B相从1-40％，流速为0.3mL/min，柱温65℃；质谱条件:采用正离子模式，喷雾电压为4.0kV；离子传输管温度为325℃；S-lens为60％，扫描模式为DDA,选择一级谱图中相对强度最高的3个离子去做二级碎裂；一级扫描为Orbitrap；扫描范围为m/z200-2000；分辨率为60K；碰撞模式为CID；碰撞能量为35％；二级扫描为离子阱；扫描速度为Normal。7.如权利要求2所述的基于质谱技术实现单克隆抗体药物氨基酸序列的测序方法，其特征在于，所述将一级、二级谱图用Peaks软件进行denovo解析，获得初步的氨基酸序列结果具体方法为采用SwissProt人数据库和添加的该单抗蛋白氨基酸序列合并后进行蛋白质鉴定，鉴定采用PeaksStudio...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈钢，汪泓，邵泓，尹红锐，
申请(专利权)人：上海市食品药品检验所，
类型：发明
国别省市：上海,31