一种轮虫的筛选方法技术

本发明专利技术提供一种轮虫的筛选方法，涉及生物筛选技术领域；用于筛选有性生殖倾向最低的轮虫，包括：将多个目标轮虫品系分别稳定化增殖建立单克隆培养母种群，从其中选择带卵轮虫使其于环境密度≤0.1ind./ml的条件下生产F1代轮虫幼体，将F1代轮虫幼体放置于不同体积的轮虫培养液中单独培养；将各F1代轮虫产生的F2代幼体分别挑出单独培养，计算各F2代有性个体比率；将F2代有性个体比率和对应的F1代种群密度进行非线性拟合求得有性生殖阈密度；将多个目标轮虫品系的有性生殖阈密度进行比较，得有性生殖倾向最低的轮虫品系。该方法快速、精准的筛选有性生殖倾向最低的轮虫品系，从而节约生产成本，具有极佳的推广价值。

Method for screening rotifers

The present invention provides a method of screening a rotifer, relates to the technical field of biological screening; screening for sexual reproduction of rotifer tended to be the lowest, including: a plurality of target rotifer strains stabilized proliferation respectively establish monoclonal culture of parent population, the production of F1 generation larvae rotifers from which to choose with the environment in the eggs of rotifer density is less than 0.1ind./ml under the condition of the F1 generation larvae placed in different volume of rotifers rotifers cultured in single culture; the F1 rotifers produce F2 generation larvae were singled out cultured alone, calculate the F2 generation of individual sexual ratio; F1 population density F2 generation sexual ratio and corresponding to a nonlinear fitting for sexual reproduction threshold density; multiple target strains of sexual reproduction of rotifer density threshold compared to sexual reproduction of rotifer strains with the lowest tendency. The method is rapid and accurate for screening rotifer strains with lowest sexual reproductive tendency, thereby saving production costs and having excellent popularization value.

【技术实现步骤摘要】
一种轮虫的筛选方法
本专利技术涉及生物筛选
，且特别涉及一种轮虫的筛选方法。
技术介绍
不论是海水鱼还是淡水鱼，在育苗及幼体培育期间，其开口活饵料主要选用轮虫。按照每尾育苗每天摄食20～50只轮虫来计算，1个生产5000万尾鱼苗的中小型育苗企业，每天对轮虫的需求量就需要达到15～25亿只，按照1：1的比例采收轮虫来计算，育苗单位每天需要生产25～50亿只轮虫。轮虫大多数品系为周期性孤雌繁殖，即其生活史由孤雌繁殖和有性繁殖两部分构成。通常情况下，轮虫通过高效的孤雌繁殖过程增加种群数量，但是在高密度养殖条件下，则启动有性繁殖，产生休眠卵来抵御不良环境条件。有性繁殖的产生大大限制了种群繁殖的效率，甚至有崩溃的危险，从而限制了轮虫的产量，所带来的是活饵料供应不足的问题。因此实际生产中需要得到有性生殖倾向低的轮虫品系扩大培养，而该筛选方法目前尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种轮虫的筛选方法，用于快速、精准的筛选有性生殖倾向最低的轮虫品系，从而解决高密度培养条件下轮虫的有性生殖所带来的轮虫饵料供应不足的问题，提高培养效率，节约生产成本，具有极佳的推广价值。本专利技术解决其技术问题是采用以下技术方案来实现的。本专利技术提出一种轮虫的筛选方法，用于筛选有性生殖倾向最低的轮虫，包括：将多个目标轮虫品系分别于环境密度≤0.1ind./ml的条件下稳定化增殖2-4周，建立单克隆培养母种群，从单克隆培养母种群中选择带卵轮虫作为母体，使其于环境密度≤0.1ind./ml的条件下生产F1代轮虫幼体，将龄长<2h的F1代轮虫幼体分别放置于不同体积的轮虫培养液中单独培养，并使得各F1代轮虫在发育过程中经历稳定的种群密度，每天更换一次轮虫培养液。将不同种群密度下培养的各F1代轮虫产生的F2代幼体分别挑出单独培养，计算各F1代轮虫种群对应的F2代有性个体比率。将F2代有性个体比率和对应的F1代经历的种群密度进行非线性拟合，求得各F1代轮虫种群的有性生殖阈密度。将多个目标轮虫品系的F1代轮虫种群的有性生殖阈密度进行比较，得有性生殖倾向最低的轮虫品系。本专利技术较佳实施例提供的轮虫的筛选方法的有益效果是：通过多个目标轮虫品系分别于环境密度≤0.1ind./ml的条件下稳定化增殖以及于环境密度≤0.1ind./ml的条件下生产F1代幼体，有效控制母系效应对轮虫F1代以及F2代的影响，提高实验结果的可重复性。通过不同种群密度的F1代轮虫种群以及对应的F2代有性个体比率进行非线性拟合，求得各F1代轮虫种群的有性生殖阈密度；并通过比较多个目标轮虫品系的有性生殖阈密度，得到有性生殖阈密度值最高的，即有性生殖倾向最低的轮虫，并用于大批量培养，可显著提高生产种群的轮虫最大培养密度，有利于高密度集约化培养，从而节约生产成本。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本专利技术的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术试验例提供的各品系轮虫种群(有性生殖阈密度不同)的种群增长图。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。下面对本专利技术实施例的一种轮虫的筛选方法进行具体说明。一种轮虫的筛选方法，用于筛选有性生殖倾向最低的轮虫，包括：将多个目标轮虫品系分别于环境密度≤0.1ind./ml的条件下稳定化增殖2-4周，建立单克隆培养母种群。其中，本专利技术中目标轮虫品系可以为不同品种的轮虫，也可以为同一品种采集自不同地区的轮虫，例如不同地区采集的萼花臂尾轮虫(Brachionuscalyciflorus)，本领域工作人员可根据实际情况进行选定，在此不做限定。由于跨代母体效应在轮虫有性生殖的倾向性方面具有显著影响，且建立单克隆培养母种群需要轮虫不断的生殖，而有性生殖则会产生休眠卵以及雄卵，降低种群增长速度，加大实验成本以及影响实验效果，因此采用孤雌生殖快速稳定的建立单克隆培养母种群。经专利技术人发现，于环境密度≤0.1ind./ml的条件下稳定化增殖2-4周是建立单克隆培养母种群的最佳时间以及最佳环境密度，该密度下，轮虫进行孤雌生殖效果佳且培养成本较为低廉。优选地，目标轮虫品系由从野外采集的休眠卵置于盛有轮虫培养液的容器内，将容器放置于20-25℃，光周期L：D＝16:8、光照强度为1000-3000lx的恒温培养箱中孵化而得。该条件下，孵化速率快，孵化后的轮虫成活率高。其中休眠卵采集是指在野外，从水流静缓的河汊、池塘、海边潟湖等处采集富含休眠卵的底泥，将底泥放置于黑暗低温的容器中带回实验室，并置于冰箱中。优选地，于孵化步骤开始前将野外采集的休眠卵放置于4-5℃的条件下进行保存，该温度范围内，休眠卵保存时间长，且活性高，温度过高，会导致休眠卵孵化，温度过低，会影响休眠卵的活性。优选地，将孵化而得的每个轮虫单独转移至第二细胞培养板内，每孔加入2-5ml的轮虫培养液，每隔1-2天更换一次轮虫培养液，获得各轮虫的单克隆培养种群作为目标轮虫品系。具体地，单克隆培养种群的密度为≤1ind./ml，种群规模至少达到1000只个体，可为后续实验提供足够的实验样本。由于有时实验并非在单克隆培养种群建立后立即进行操作，因此优选地，将目标轮虫品系进行稳定化增殖之前，于15-20℃之间，保持种群密度为1ind./ml的情况下稳定培养15-30天。期间，可通过每天更换培养液和随机挑出一些个体的办法控制食物浓度以及种群密度，使轮虫受食物浓度、环境温度和种群密度影响的母系效应一致化，从而后续实验的可重复性佳。更优选地，将目标轮虫品系进行稳定化增殖之前，于15℃，保持种群密度1ind./ml的情况下稳定培养30天，目标轮虫品系的活性佳。更优选地，将目标轮虫品系进行稳定化增殖之前，在20℃，保持种群密度1ind./ml的情况下稳定培养15天，目标轮虫品系的活性佳。从单克隆培养母种群中选择带卵轮虫作为母体，使其于环境密度≤0.1ind./ml的条件下生产F1代幼体，此时在该低密度环境下生产出的F1代幼体理论上均为非混交雌体。将龄长<2h的F1代幼体分别放置于不同体积的轮虫培养液中单独培养，并使得F1代个体在发育过程中经历稳定的种群密度，通过计算获得每个F1代轮虫所生活的种群密度。期间每天更换一次轮虫培养液，保证食物浓度相同。在本专利技术其他实施例中，还可以采用将不同数量的F1代幼体分别放置于同样体积的轮虫培养液中，建立不同的种群密度的各F1代轮虫。需注意的是：这里使F1代个体在发育过程中经历稳定的种群密度最好包括小于0.1ind./ml的数值以及大于0.1ind./ml的数值，这样设置的原因是轮虫的有性生殖与种群密度密切相关，因此F1代轮虫的种群密度大于0.1ind./ml，F1代会受到自体产生的有性生殖诱导信号的刺激，其后代中会有一定比例的个体为混交雌体，而F1代轮虫种群的种群密度小于0.1ind./ml的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种轮虫的筛选方法，用于筛选有性生殖倾向最低的轮虫，其特征在于，包括：将多个目标轮虫品系分别于环境密度≤0.1ind./ml的条件下稳定化增殖2‑4周，建立单克隆培养母种群，从所述单克隆培养母种群中选择带卵轮虫作为母体，使其于环境密度≤0.1ind./ml的条件下生产F1代轮虫幼体，将龄长<2h的F1代轮虫幼体分别放置于不同体积的轮虫培养液中单独培养，并使得各F1代轮虫在发育过程中经历稳定的种群密度，每天更换一次轮虫培养液；将不同种群密度下培养的各F1代轮虫产生的F2代幼体分别挑出单独培养，计算各F1代轮虫对应的F2代有性个体比率；将F2代有性个体比率和对应的F1代种群密度进行非线性拟合，求得各F1代轮虫的有性生殖阈密度；将多个目标轮虫品系的F1代轮虫的有性生殖阈密度进行比较，得有性生殖倾向最低的轮虫品系。

【技术特征摘要】
1.一种轮虫的筛选方法，用于筛选有性生殖倾向最低的轮虫，其特征在于，包括：将多个目标轮虫品系分别于环境密度≤0.1ind./ml的条件下稳定化增殖2-4周，建立单克隆培养母种群，从所述单克隆培养母种群中选择带卵轮虫作为母体，使其于环境密度≤0.1ind./ml的条件下生产F1代轮虫幼体，将龄长<2h的F1代轮虫幼体分别放置于不同体积的轮虫培养液中单独培养，并使得各F1代轮虫在发育过程中经历稳定的种群密度，每天更换一次轮虫培养液；将不同种群密度下培养的各F1代轮虫产生的F2代幼体分别挑出单独培养，计算各F1代轮虫对应的F2代有性个体比率；将F2代有性个体比率和对应的F1代种群密度进行非线性拟合，求得各F1代轮虫的有性生殖阈密度；将多个目标轮虫品系的F1代轮虫的有性生殖阈密度进行比较，得有性生殖倾向最低的轮虫品系。2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，F2代有性个体比率由以下方式获得：将挑出的F2代幼体分别置于第一细胞培养板内，所述第一细胞培养板的每个孔内添加有0.15-0.22ml的轮虫培养液，每24h更换一次轮虫培养液，直至可以通过F2代带卵情况分辨F2代为混交雌体或非混交雌体，通过混交雌体数量与雌体总数的比率得各F2代有性个体比率。3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述目标轮虫品系由从野外采集的休眠卵置于盛有轮虫培养液的容器内，将容器放置于20-25℃，光周期L：D＝16:8、光照强度为1000-3000lx的恒温培养箱中孵化而...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙栋，牛翠娟，
申请(专利权)人：国家海洋局第二海洋研究所，北京师范大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33