组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法技术

本发明专利技术提供一种利用组培技术和发根农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　　ｒｈｉｚｏｇｅｎｅ）生根质粒上的一段Ｔ－ＤＮＡ对虎杖外植体进行遗传转化诱导培养所产生的毛状根来生产虎杖苷的方法。它包括如下步骤：Ａ、野生虎杖组培；Ｂ、发根农杆菌的活化培养；Ｃ、虎杖毛状根的诱导培养；Ｄ、虎杖毛状根优化培养；Ｅ、虎杖毛状根中虎杖苷的提取。本发明专利技术的技术进步效果表现在：与从野生虎杖根及根茎中提取虎杖苷和白藜芦醇的现今生产方式相比，利用毛状根来生产以根入药为主的药用植物的某些有效成分，具有生产周期短、质量和产量稳定、不占用耕地等优点，而且天然药物的生产是在可控和可重复条件下进行，不会受到病虫害和自然环境等因素的影响。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到一种，属于植物生物

技术介绍
虎杖苷(polydatin)和白藜芦醇(resVeratrol)均为植物体内天然产生的二苯乙烯类多酚物质，是具有明确的化学结构和确切疗效的单体化合物，对人体具有强心扩血管、抑制血小板凝集、降血脂、抗病毒和增强机体免疫力等作用，更为重要的是其特异性地针对癌细胞具有杀伤力而不影响正常细胞，被誉为“二十一世纪最有前途的抗癌药物之一”，因此广泛应用于临床医疗及保健业，国内外市场需求量很大。虎杖苷和白藜芦醇在自然界的很多植物中都存在，例如葡萄、花生、藜芦、虎杖、欧洲云杉等，其中以在虎杖中的含量最为丰富，远远超过其他植物。目前制药工业主要依靠从大量采挖的野生虎杖根及根茎中提取虎杖苷和白藜芦醇，据统计提取10吨白藜芦醇需要消耗5000吨虎杖原料。虎杖苷和白藜芦醇在植物体内的含量不仅普遍较低，而且还明显受到产地、采收季节以及生长环境等因素的影向，例如云南地区的虎杖根茎中虎杖苷的含量为3.24％，而广东一带仅为0.64％；同一产地的虎杖八月份采收时其根茎中含有白藜芦醇0.30％，到十月份采收时就降为0.04g％，所以单纯依靠从植物原料中提取的方法，不仅质量难以控制，而且生产周期长、成本高、产品得率低，更为严重的是长期掠夺式地采挖还会加快野生资源的灭绝速度，不符合我国经济可持续发展的战略要求。如何在不破坏自然资源的条件下，生产出质量可控、纯度较高的白藜芦醇及其苷类，是当前研究的热点问题。生物合成(biosynthesis)，即通过对植物高产细胞、组织或器官的筛选与优化培养，将植物体作为一个“药物加工厂”，在特定的生物反应器内达到目标成分的高效产出，对于解决中草药资源的可持续利用及天然药物的生产问题具有重要意义。目前，利用生物合成途径生产虎杖苷或白藜芦醇的研究主要集中在细胞培养物方面，例如专利00113914.2公开了利用葡萄细胞株生产白藜芦醇的技术方案。但是利用细胞培养物进行次生代谢物的大规模生产存在许多不足，例如细胞普遍生长缓慢且依赖激素维持、含量低下、遗传稳定性差和放大培养时对剪切力敏感等。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是利用组培技术和发根农杆菌(Agrobacter ium rhizogene)生根质粒上的一段T-DNA对虎杖外植体进行遗传转化诱导培养所产生的毛状根来生产虎杖苷的方法。本专利技术的技术方案是这样实现的，其特征在于它包括如下步骤A、野生虎杖组培选取发育良好的野生虎杖植株茎段顶部的幼芽，消毒处理后经分化培养，壮苗培养，生根培养形成发育完整的幼苗，切取无菌组培苗的茎段、叶片、叶柄及幼芽等外植体作为感染材料备用；B、发根农杆菌的活化培养取出冰箱保存的发根农杆菌菌株ATCC11325室温平衡20～30min，然后在超净工作台上吸取500～800μl菌液于已灭菌的100～150ml新鲜YEB培养液中，于23～27℃、120～160r·min-1、黑暗振荡培养20～24h即可；C、虎杖毛状根的诱导培养划伤受体材料表面以形成伤口，放入步骤B的农杆菌菌液中浸泡5sec～15min使之充分接触，取出感染材料用无菌吸水纸轻轻蘸干多余菌液，24～27℃、黑暗条件下置于MS0中进行共培养。7～15天后在感染材料的伤口部位可见毛状根的萌生；D、虎杖毛状根优化培养经分子鉴定后采用1/2MS0液体培养基，附加3％蔗糖作为碳源，在pH值为6.0～6.5，温度22～27℃，摇床转速120～140r·min-1，黑暗或弱光条件下6～30天获得大量增殖的毛状根株系；E、虎杖毛状根中虎杖苷的提取从培养液中取出毛状根、烘干、研磨成粉末，用50％(V∶V)乙醇结合30～40min超声波处理进行提取，之后于3000r/min离心15～20min，取上清液减压浓缩，再经过柱层析分离、浓缩、结晶、冷冻干燥，即可得到纯度较高的虎杖苷产品。所述的，步骤A中对野生材料的消毒方法是采用流水冲洗干净后置于超净工作台上，75％(V∶V)酒精浸泡10～30sec，无菌水漂洗三次后再置于0.1％(W∶V)升汞溶液中表面消毒3～8min，无菌水充分漂洗后即可接种；诱导丛生芽分化的培养基是指MS+0.05mg/LTDZ+0.5mg/L NAA+0.1mg/L 6-BA；壮苗生长的培养基是指MS+0.1mg/LCPPU+1.0mg/L NAA，生根培养基是指MS+1.0mg/L NAA+0.5％活性炭；上述培养条件均为白天27±1℃，夜晚20±1℃湿度60～70％，光强28μmol/m2.s，光照时间13～17h/d。所述的，提高步骤G所述的虎杖毛状根诱导率的方法包括a、发根农杆菌与根癌农杆菌双感染；b超声波振荡辅助感染；c，微波辐射辅助感染；d、选取成熟叶的叶片部分作为感染材料；e、感染叶片不经预培养且共培养时叶片上表皮向上放置；或f、黑暗、室温环境下诱导根的发生。所述的，步骤D所述的分子鉴定是指切取从感染材料上产生的毛状根根段，分离成单根后转接至MS0固体培养基中生长，10～15天继代培养一次；从大量的单克隆毛状根系中筛选生长迅速、外形粗壮、分枝较多的毛状根进行PCR分子鉴定，证实具有转发根农杆菌T-DNA性质的毛状根进入下一步操作。所述的，步骤D所述的培养周期6～24天内采取每7天更换培养液一次。所述，将步骤D得到虎杖毛状根进行固体种质保存以用于工业化生产。所述，将生长迅速、含量较高且遗传稳定的优良虎杖毛状根单克隆系，保存于添加有1％活性碳并提高蔗糖含量至5％的MS固体培养基中。所述，将步骤D得到的虎杖毛状根在优化条件下扩大培养以便定期收获毛状根，继代培养时接种量控制在0.5～1.0g鲜重毛状根100～150ml培养液。所述，可同时制备白藜芦醇提取物。本专利技术的技术进步效果表现在(1)与从野生虎杖根及根茎中提取虎杖苷和白藜芦醇的现今生产方式相比，利用毛状根来生产以根入药为主的药用植物的某些有效成分，具有生产周期短、质量和产量稳定、不占用耕地等优点，而且天然药物的生产是在可控和可重复条件下进行，不会受到病虫害和自然环境等因素的影响。(2)与化学合成的方法相比，利用毛状根培养物生物合成途径除了可提供虎杖苷和白藜芦醇外，还可直接生产出前体及其他具有药理活性结构而化学手段很难合成的化合物，此外产物可无限、连续、均匀的生产，分离、提取操作简单，节约人力物力。(3)与利用其他组织培养物(如自然根、愈伤组织、悬浮细胞等)生产方式相比，毛状根中由于导入了发根农杆菌Ri质粒上的T-DNA，具有不依赖激素自主快速生长的特性，而其他培养物必须添加昂贵或对人体有毒害的外源激素来维持其生长。在本专利技术具体实施例中筛选获得的优质虎杖毛状根株系，在30d培养期内干重增长率可达到8.29，是相同条件下悬浮培养细胞的192.8倍，是自然根培养物的8.4倍。此外，毛状根遗传性能稳定，继代操作简单，生长不需要光照，成本低廉，更适于工厂化生产。(4)本专利技术利用野生型发根农杆菌和根癌农杆菌双菌共感染的方式，不仅可以明显提前出根，而且有效提高了毛状根的诱导率及诱根密度，毛状根平均诱导率可达到97.1％，诱根密度达到15.8，远远高于同属其他植物。此外，与以往文献报道不同的是，本项技术中感受材料不需预培养，划伤后直接浸泡于活化好的菌液中，在叶片本文档来自技高网...

【技术保护点】
组培诱导虎杖毛状根制备虎杖苷的方法，其特征在于：它包括如下步骤：Ａ、野生虎杖组培：选取发育良好的野生虎杖植株茎段顶部的幼芽，消毒处理后经分化培养，壮苗培养，生根培养形成发育完整的幼苗，切取无菌组培苗的茎段、叶片、叶柄及幼芽等外植体作 为感染材料备用；Ｂ、发根农杆菌的活化培养：取出冰箱保存的发根农杆菌菌株ＡＴＣＣ１１３２５平衡２０～３０ｍｉｎ，然后在超净工作台上吸取５００～８００μｌ菌液于已灭菌的１００～１５０ｍｌ新鲜ＹＥＢ培养液中，于２３～２７℃、１２０～１６０ ｒ.ｍｉｎ↑［－１］、黑暗振荡培养２０～２４ｈ即可；Ｃ、虎杖毛状根的诱导培养：划伤受体材料表面以形成伤口，放入步骤Ｂ的农杆菌菌液中浸泡５ｓｅｃ～１５ｍｉｎ使之充分接触，取出感染材料用无菌吸水纸轻轻蘸干多余菌液，２４～２７℃、黑暗条件 下置于ＭＳ↓［０］中进行共培养７～１５天后在感染材料的伤口部位可见毛状根的萌生；Ｄ、虎杖毛状根优化培养：经分子鉴定后采用１／２ＭＳ↓［０］液体培养基，附加３％蔗糖作为碳源，在ｐＨ值为６．０～６．５，温度２２～２７℃，摇床转速：１２０ ～１４０ｒ.ｍｉｎ↑［－１］，在黑暗或弱光条件下６～３０天获得大量增值的毛状根株；Ｅ、虎杖毛状根中虎杖苷的提取：从培养液中取出毛状根、烘干、研磨成粉末，用５０％（Ｖ∶Ｖ）乙醇结合３０～４０ｍｉｎ超声波处理进行提取，之后于３０００ｒ／ ｍｉｎ离心１５～２０ｍｉｎ，取上清液减压浓缩，再经过柱层析分离、浓缩、结晶、冷冻干燥，即可得到纯度较高的虎杖苷产品。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：于树宏，范庆书，查建蓬，张嫡群，
申请(专利权)人：河北医科大学，
类型：发明
国别省市：13[中国|河北]