细薄星芒海绵总三萜提取物及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及医药技术领域，是细薄星芒海绵总三萜提取物及其制备方法和抗肿瘤用途。本发明专利技术制备的提取物中三萜类化合物占５０－９０％。经体外抗肿瘤活性试验、中空纤维法确定体内抗肿瘤谱、体内抗肿瘤试验，证明具有显著的抗肿瘤活性，因此可用于制备抗肿瘤药物。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医药
，是细薄星芒海绵中的总三萜提取物及其制备方法和抗肿瘤用途。
技术介绍
细薄星芒海绵(Stelletta tenuis Lindgren)属寻常海绵纲(Demospongiae)、星骨海绵目(Astrophorida)、星芒海绵科(Stellettidae)星芒海绵属(Stelletta)动物。该种海绵在中国南海海域分布广泛，数量众多，易于采集，且一般生长在海底裸露岩石上。本申请人从采自中国南海海域的细薄星芒海绵中提取初提物，发现其具有细胞毒活性，进而从中分离得到十二种异玛拉巴烷(isomalabaricane)型三萜类化合物，它们是stellettinA、B、C、D、E、H，geoditinA、B，isogeoditinA、B，22，23-dihydrostellettin B及rhabdastrellic acid，它们的化学结构如下 这些化合物大都具有一定的细胞毒活性，但未见有抗肿瘤活性报道。
技术实现思路
本专利技术提供一种具有抗肿瘤活性的细薄星芒海绵总三萜提取物(AGH)，提取物中总三萜有效部位的含量为50～90％，经体外抗肿瘤试验、中空纤维法确定体内抗肿瘤谱及动物体内试验，证明它具有较强的抗肿瘤活性。本专利技术细薄星芒海绵总三萜提取物的制备方法如下将干燥的细薄星芒海绵粉碎，用体积/重量比为5～10倍的50％～95％乙醇渗漉提取，减压回收乙醇，加入二氯甲烷萃取，减压回收二氯甲烷，得总浸膏，将总浸膏溶于80％～95％的甲醇，用石油醚萃取，弃去石油醚层，调整甲醇浓度至65％～75％，用四氯化碳萃取，回收四氯化碳，将所得药膏浓缩至干，过Sephandex LH20凝胶柱，用体积比为0～1∶1～0的二氯甲烷/甲醇或体积比为10～4∶10～5∶1的正己烷/二氯甲烷/甲醇洗脱，收集浅黄色部分，回收溶剂浓缩至干，过200～400目正相硅胶柱，以体积比为1∶0～0∶1石油醚/乙酸乙酯或体积比为1∶0～0∶1的石油醚/丙酮梯度洗脱，收集浅黄色部分，回收溶剂浓缩至干，得细薄星芒海绵总三萜提取物，得率不小于1.0％。本专利技术细薄星芒海绵提取物中总三萜含量的测定是以stellettin B或stellettinD为对照品，采用外标法进行的，具体方法如下色谱条件与系统适用性实验YMC高效液相色谱柱YMC Pack-SIL分析柱(250mm×4.6mm，5μn)；流动相A为正己烷，流动相B为乙酸乙酯，流动相A梯度洗脱(75％～3％)，分析时间为50min，其中0-30minA∶B保持在75％∶25％，30-35minA∶B从75％∶25％～3％∶97％，35-50minA∶B保持在3％∶97％；流速1.0mL·min-1；色谱峰光谱采集范围180-400nm；检测波长360nm；柱温室温；进样量20μL。对照品溶液的制备精密称取对照品Stellettin D 8.0mg，加乙酸乙酯溶解，0.45μm膜过滤，使浓度分别成为0.1，0.13，0.32，0.64，0.96，1.28mg·mL-1，置于4℃冰箱保存备用；精密称取对照品Stellettin B 9.0mg，加乙酸乙酯及少量二氯甲烷溶解，0.45μm膜过滤，使浓度为0.12，0.3，0.6，0.9，1.2，1.5mg·mL-1，置于4℃冰箱保存备用。供试品溶液的制备精密称取本专利技术总三萜干粉1.Smg，用1000μL乙酸乙酯溶解，0.45μm膜过滤，置于4℃冰箱保存备用。测定方法基于对对照品的稳定性、精密度、重复性和保留时间变化的考察，得stellettin B和stellettin D的标准曲线方程分别为Y＝52181633X+957495，r＝0.9699；Y＝62636828X-451022，r＝0.9980。精密吸取供试液20μL，注入高效液相色谱仪，测定，计算细薄星芒海绵总三萜的含量。结果为，本专利技术细薄星芒海绵提取物中总三萜的含量达50～90％。本专利技术细薄星芒海绵提取物中三萜类化合物的分析方法为将提取物经减压硅胶柱层析(200-300目)，石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，得7个流份(1-7)；流份4过Sephandex LH20凝胶柱，用流动相为4∶5∶1(v/v)的正己烷/二氯甲烷/甲醇洗脱，反复进行硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯洗脱，得stellettinA、B，22，23-dihydrostellettin B；流份5过Sephandex LH20凝胶柱，用流动相为4∶5∶1(v/v)的正己烷/二氯甲烷/甲醇洗脱，反复进行硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯洗脱，得stellettin C、D；流份6过Sephandex LH20凝胶柱，用流动相为4∶5∶1(v/v)的正己烷/二氯甲烷/甲醇洗脱，反复进行硅胶柱层析，用石油醚/乙酸乙酯洗脱，然后经半制备HPLC纯化，以正己烷/乙酸乙酯(7∶3)作流动相，得geoditin A、B，isogeoditin A、B；流份7过Sephandex LH20凝胶柱，用流动相为4∶5∶1(v/v)的正己烷/二氯甲烷/甲醇洗脱，反复进行硅胶柱层析，用二氯甲烷/甲醇洗脱，得stellettin E、H和rhabdastrellic acid。化合物的核磁共振13C谱和1H谱数据见表1-4，参照文献(1.Fang Lv，Zhiwei Deng，Jun Li.Isomalabricane-Type compounds from the marine sponge Rhabdastrella aff.Distincta.J Nat Prod.2004，67(12)2033.2.McCormick JL，McKee TC，Cardellina JH，et al.Cytotoxic triterpenes from a marine sponge，Stelletta sp.J Nat Prod，1996，59(11)1047.3.Tasdemir D.Bioactive isomalabaricane triterpenes from the marine spongeRhabdastrella globostellata.J Nat Prod，2002，65(2)210.)，确定化合物结构。表1 StellettinA-D，E，H的1H NMR数据 表2 Geoditin A、B，isogeoditin A、B，22，23-dihydrostellettin B及rhabdastrellic acid的1HNMR数据 表3 StellettinA-D，E，H的1C NMR数据 表4 Geoditin A、B，isogeoditin A、B，22，23-dihydrostellettin B及rhabdastrellic acid的1C NMR数据 附图说明图1本专利技术提取物(AGH)对裸小鼠人肠癌HT-29的生长抑制曲线图。具体实施例方式下面结合实施例，对本专利技术作详细描述，但不局限于这些实施例。实施例1 本专利技术提取物的制备取干燥的细薄星芒海绵10kg，粉碎，用体积/重量比为6倍的75％乙醇渗漉提取，减压回收乙醇，加入二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细薄星芒海绵总三萜提取物的制备方法，步骤如下：将干燥的细薄星芒海绵粉碎，用体积／重量比为５～１０倍的５０％～９５％乙醇渗漉提取，减压回收乙醇，加入二氯甲烷萃取，减压回收二氯甲烷，得总浸膏，将总浸膏溶于８０％～９５％的甲醇，用石油醚萃取，弃去石油醚层，调整甲醇浓度至６５％～７５％，用四氯化碳萃取，回收四氯化碳，将所得药膏浓缩至干，过ＳｅｐｈａｎｄｅｘＬＨ２０凝胶柱，用体积比为０～１∶１～０的二氯甲烷／甲醇或体积比为１０～４∶１０～５∶１的正己烷／二氯甲烷／甲醇洗脱，收集 浅黄色部分，回收溶剂浓缩至干，过２００～４００目正相硅胶柱，以体积比为１∶０～０∶１石油醚／乙酸乙酯或体积比为１∶０～０∶１的石油醚／丙酮梯度洗脱，收集浅黄色部分，回收溶剂浓缩至干，得细薄星芒海绵总三萜提取物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林厚文，王增蕾，刘皋林，陈万生，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]