用序列标签进行大规模生物分子分析制造技术

本发明专利技术涉及通过对一个或多个序列标签进行多重扩增，并将所述序列标签附接至靶核酸和/或其拷贝，然后对所述扩增产物进行高通量测序，从而执对核酸群体进行基于序列的分析。在一些实施例中，本发明专利技术包括以下连续步骤：延伸引物、去除未延伸的引物和添加新的引物用于扩增(例如通过PCR)或用于额外的引物延伸。本发明专利技术的一些实施例涉及对接受癌症治疗的患者进行微小残留病灶(MRD)分析。将序列标签引入序列读段为测定克隆型提供了有效方法，同时为检测来自同一患者的其他样本的遗留污染或来自曾在同一实验室中曾检测的其他患者的样本的遗留污染提供了一种便利方法。

Large scale biomolecular analysis with sequence tags

The present invention relates to one or more sequence tags for multiplex amplification, and the sequence tags attached to the target nucleic acid and / or its copy, followed by high-throughput sequencing of the PCR products, which hold based on the sequence analysis of nucleic acid groups. In some embodiments, the present invention comprises the following steps: an extension primer, an extension of the primer, and addition of a new primer for amplification (e.g., by PCR) or an additional primer extension. Some embodiments of the present invention relate to the analysis of minimal residual disease (MRD) in patients receiving cancer treatment. The sequence tag reads the sequence provides an effective method for the determination of cloning, legacy of pollution legacy of pollution of other samples from the same patient at the same time for the detection or other patients from detection once in the same laboratory in the sample provides a convenient way to.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉引用本专利申请要求于2013年7月1日提交的美国临时专利申请No.61/841,878以及于2014年5月21日提交的美国临时专利申请No.62/001,580的优先权，两者均以引用方式全文并入本文。序列表本申请包含序列表，该序列表以ASCII格式通过EFS-Web提交并且据此全文引入以供参考。所述ASCII副本创建于2014年6月27日，名称为848US00-SL-ST25.txt，文件大小为2千字节。没有添加新客体。
技术介绍
由于大规模DNA测序的速度和便利性提高，并且其每个碱基的成本降低，所以大规模DNA测序在诊断和预后中的应用迅速扩展，例如Dingetal,Nature,481(7382):506-510(2012)(Ding等人，《自然》，2012年，第481卷，第7382期，第506-510页)；Chiuetal,Brit.Med.J.,342:c7401(2011)(Chiu等人，《英国医学期刊》，2011年，第342卷，第c7401页)；Kuetal,AnnalsofNeurology,71(1):5-14(2012)(Ku等人，《神经学年鉴》，2012年，第71卷，第1期，第5-14页)等等。具体地讲，编码免疫分子(如T细胞或B细胞受体，或者它们的组分)的核酸谱包含大量有关生物体健康状态或疾病的信息，因而已提出将此类谱用作多种病症的诊断或预后指标，例如FahamandWillis,U.S.patents8,236,503and8,628927(Faham和Willis，美国专利8,236,503和8,628927)；Freemanetal,GenomeResearch,19:1817-1824(2009)(Freeman等人，《基因组研究》，2009年，第19卷，第1817-1824页)；Hanetal,J.Immunol.,182(1001):42.6(2009)(Han等人，《免疫学杂志》，2009年，第182卷，第1001期，第42.6页)；Boydetal,Sci.TranslMed.,1(12):12ra23(2009)(Boyd等人，《科学转化医学》，2009年，第1卷，第12期，第12-23页)；Heetal,Oncotarget(March8,2011)(He等人，《肿瘤标靶》，2011年3月8日)。举例来说，许多经治疗的癌症患者常常留有与癌症有关的微小残留病灶(MRD)。也就是说，即使可通过临床措施使患者的疾病响应治疗而得以完全缓解，但由于这样或那样的原因，一小部分癌细胞可能未被消灭而保留下来。对于患者的继续治疗而言，这种残留群体的类型和大小是重要的预后因子，例如Campana,Hematol.Oncol.Clin.NorthAm.,23(5):1083-1098(2009)(Campana，《北美血液学与肿瘤学临床》，2009年，第23卷，第5期，第1083-1098页)；Buccisanoetal,Blood,119(2):332-341(2012)(Buccisano等人，《血液》，2012年，第119卷，第2期，第332-341页)。因此，人们已开发了若干用于评估这种群体的技术，包括基于流式细胞术、原位杂交、细胞遗传学、核酸标记扩增等的技术，例如Buccisanoetal,CurrentOpinioninOncology,21:582-588(2009)(Buccisano等人，《肿瘤学新见》，2009年，第21卷，第582-588页)；vanDongenetal,Leukemia,17(12):2257-2317(2003)(vanDongen等人，《白血病》，2003年，第17卷，第12期，第2257-2317页)等等。从T细胞和/或B细胞扩增编码免疫受体(即克隆型)区段的重组核酸，对于评估白血病和淋巴瘤MRD特别有用，因为此类克隆型通常具有独特的序列，这些独特的序列可用作这些克隆型的相关癌细胞的分子标签。由于此类扩增是高度多重化的而难以建立，所以通常通过对编码单一受体链的核酸进行扩增和测序来部分地进行此类测定。随着多重扩增规模增大而遇到了若干问题，包括：由错误杂交引起的假性扩增的概率增加、形成引物二聚体、变化的扩增率导致序列表征偏倚等等，例如Elnifroetal,ClinicalMicrobiologyReviews,13(4):559-570(2000)(Elnifro等人，《临床微生物学评论》，2000年，第13卷，第4期，第559-570页)。此外，无论对于序列分析、样本跟踪、污染检测，还是诸如此类的工作，靶序列的相似性以及将序列标签掺入扩增序列均会加剧上述与大规模扩增有关的困难。这些困难阻碍了多免疫受体链的大规模单反应扩增的发展，而多免疫受体链的大规模单反应扩增将非常有利于减少测定微小病灶相关核酸序列所需的单独测定数。鉴于上文所述，如果存在更有效的方法用于评估在单一反应中选定的核酸，如癌基因的外显子或编码免疫受体链组的克隆型，那将会非常有利。
技术实现思路
本专利技术涉及如下方法：在单一反应中对靶多核苷酸(如编码免疫受体链的重组核酸)群体进行大规模扩增，特别是通过聚合酶链反应(PCR)进行大规模扩增，随后采用大规模DNA测序对其进行鉴定。本专利技术包括将上述方法应用于监测癌症的微小残留病灶。在多个具体实施和应用中示例了本专利技术，其中一些汇总如下并贯穿于整个说明书中。在一些实施例中，本专利技术涉及生成核酸谱的方法，所述核酸编码所关注的生物分子(如免疫受体分子)群体。在一个方面，本专利技术的方法包括：将序列标签附接到样本中选定的核酸群体以形成标签-核酸缀合物；扩增该标签-核酸缀合物；以及对扩增的标签-核酸缀合物进行测序，以提供序列读段，每条序列读段均包含标签序列和核酸序列，针对这些序列生成核酸谱。在一些实施例中，序列标签的附接通过一个或多个连续的引物延伸和引物去除步骤实现，然后可通过通用的正向引物和反向引物无偏倚地进一步扩增所得产物。在一些实施例中，本专利技术涉及一些方法，用于检测和测定样本中由源于不同样本的物质所带来的污染(如遗留污染)。在一个实施例中，此类用于检测受到微小残留病灶监测的个体中污染的方法可包括以下步骤：(a)从个体获得组织样本；(b)将序列标签附接到癌基因分子或重组核酸形成标签-核酸缀合物，其中至少一个核酸或其拷贝所附接的序列标签不同，并且其中癌基因分子为该个体的癌症所特有的；(c)扩增该标签-核酸缀合物；(d)对该标签-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种由多个免疫细胞受体链产生克隆型谱的方法，所述方法包括以下步骤：(a)在反应混合物中，使第一组引物在引物延伸条件下与来自B细胞和/或T细胞和/或无细胞DNA的重组核酸的样本混合，其中所述第一组中的每个引物均具有受体特异性部分，使得所述受体特异性部分在预定位置处与不同的重组核酸退火配对，然后延伸形成第一延伸产物，并且其中所述第一组中的每个引物均具有包含第一引物结合位点的5’非互补端；(b)从所述反应混合物中去除所述第一组中的未延伸引物；(c)在引物延伸条件下向所述反应混合物添加第二组引物，其中所述第二组中的每个引物均具有受体特异性部分，使得所述受体特异性部分在预定位置处与所述第一延伸产物退火配对并且具有包含第二引物结合位点的5’非互补端，所述第一组的引物和/或所述第二组的引物分别包含位于所述受体特异性部分与所述第一或第二引物结合位点之间的序列标签，并且其中所述第二组中的每个引物延伸形成第二延伸产物，使得每个第二延伸产物包含第一引物结合位点、第二引物结合位点、至少一个序列标签以及编码T细胞受体链或B细胞受体链的一部分的重组核酸；(d)在所述反应混合物中进行聚合酶链反应以形成扩增子，所述聚合酶链反应使用特异于所述第一引物结合位点的正向引物和特异于所述第二引物结合位点的反向引物；以及(e)对所述扩增子的所述核酸进行测序以形成多个T细胞受体链和/或B细胞受体链的克隆型谱。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.07.01 US 61/841,878;2014.05.21 US 62/001,5801.一种由多个免疫细胞受体链产生克隆型谱的方法，所述方法包括以
下步骤：
(a)在反应混合物中，使第一组引物在引物延伸条件下与来自B细
胞和/或T细胞和/或无细胞DNA的重组核酸的样本混合，其中
所述第一组中的每个引物均具有受体特异性部分，使得所述受
体特异性部分在预定位置处与不同的重组核酸退火配对，然后
延伸形成第一延伸产物，并且其中所述第一组中的每个引物均
具有包含第一引物结合位点的5’非互补端；
(b)从所述反应混合物中去除所述第一组中的未延伸引物；
(c)在引物延伸条件下向所述反应混合物添加第二组引物，其中所
述第二组中的每个引物均具有受体特异性部分，使得所述受体
特异性部分在预定位置处与所述第一延伸产物退火配对并且具
有包含第二引物结合位点的5’非互补端，所述第一组的引物和/
或所述第二组的引物分别包含位于所述受体特异性部分与所述
第一或第二引物结合位点之间的序列标签，并且其中所述第二
组中的每个引物延伸形成第二延伸产物，使得每个第二延伸产
物包含第一引物结合位点、第二引物结合位点、至少一个序列
标签以及编码T细胞受体链或B细胞受体链的一部分的重组核
酸；
(d)在所述反应混合物中进行聚合酶链反应以形成扩增子，所述聚
合酶链反应使用特异于所述第一引物结合位点的正向引物和特
异于所述第二引物结合位点的反向引物；以及
(e)对所述扩增子的所述核酸进行测序以形成多个T细胞受体链和/
或B细胞受体链的克隆型谱。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述多个T细胞受体链和/或B细
胞受体链包括TCRβ、TCRδ和TCRγ，并且其中所述第一组的所述
引物和所述第二组的所述引物包括位于编码TCRβ和TCRδ的VDJ
区的所述重组核酸区域旁侧的引物以及位于TCRγ的VJ区旁侧的引
物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述测序步骤包括：
产生具有错误率并且各自包含标签序列和重组核酸序列的序列
读段；
比对具有类似标签序列的序列读段，以形成具有相同序列标签
的序列读段组；
合并各组的序列读段以确定克隆型，其中每当所述序列读段组
有至少95％的可能性是不同的时，则将所述序列读段组合并成不同
的重组核酸序列；以及
由所述克隆型形成所述克隆型谱。
4.根据权利要求1所述的方法，所述方法还包括在形成所述第二延伸
产物后进行去除的第二步骤。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在解链所述第一延伸产物后，重
复进行所述第一组的所述引物的所述退火和延伸。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在解链所述第二延伸产物后，重
复进行所述第二组的所述引物的所述退火和延伸。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述去除步骤包括向所述反应混
合物添加核酸外切酶I活性。
8.一种由多个B细胞受体链产生克隆型谱的方法，所述方法包括以下
步骤：
(a)在反应混合物中，使第一组引物在引物延伸条件下与来自B细
胞和/或无细胞DNA的重组核酸的样本混合，其中所述第一组
中的每个引物均具有受体特异性部分，使得所述受体特异性部
分在预定位置处与不同的重组核酸退火配对，然后延伸形成第
一延伸产物，并且其中所述第一组中的每个引物均具有包含第
一引物结合位点的5’非互补端；
(b)从所述反应混合物中去除所述第一组中的未延伸引物；
(c)在引物延伸条件下向所述反应混合物添加第二组引物，其中所
述第二组中的每个引物均具有受体特异性部分，使得所述受体
特异性部分在预定位置处与所述第一延伸产物退火配对并且具
有包含第二引物结合位点的5’非互补端，所述第一组的引物和/
或所述第二组的引物分别包含位于所述受体特异性部分与所述
第一或第二引物结合位点之间的序列标签，并且其中所述第二

\t组中的每个引物延伸形成第二延伸产物，使得每个第二延伸产
物包含第一引物结合位点、第二引物结合位点、至少一个序列
标签以及编码B细胞受体链的一部分的重组核酸；
(d)在所述反应混合物中进行聚合酶链反应以形成扩增子，所述聚
合酶链反应使用特异于所述第一引物结合位点的正向引物和特
异于所述第二引物结合位点的反向引物；以及
(e)对所述扩增子的所述核酸进行测序以形成多个B细胞受体链的
克隆型谱。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述多个B细胞受体链包括IgH
和IgK，并且其中所述第一组的所述引物和所述第二组的所述引物
包括位于编码IgH的VDJ区、IgH的DJ区和IgK的VJ区的所述重
组核酸区域旁侧的引物。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述第一组或所述第二组的所述
引物包括至少一组嵌套引物，所述至少一组嵌套引物对所述IgH链
的V区中多个不同的引物结合位点具有特异性。
11.根据权利要求8所述的方法，其中所述测序步骤包括：
产生具有错误率并且各自包含标签序列和重组核酸序列的序列
读段；
比对具有类似标签序列的序列读段，以形成具有相同序列标签
的序列读段组；
合并各组的序列读段以确定克隆型，其中每当所述序列读段组
有至少95％的可能性是不同的时，则将所述序列读段组合并成不同
的重组核酸序列；以及
由所述克隆型形成所述克隆型谱。
12.根据权利要求8所述的方法，所述方法还包括在形成所述第二延伸
产物后进行去除的第二步骤。
13.根据权利要求8所述的方法，其中在解链所述第一延伸产物后，重
复进行所述第一组的所述引物的所述退火和延伸。
14.根据权利要求8所述的方法，其中在解链所述第二延伸产物后，重
复进行所述第二组的所述引物的所述退火和延伸。
15.根据权利要求8所述的方法，其中所述去除步骤包括向所述反应混
合物添加核酸外切酶I活性。
16.一种用于确定样本中编码多个免疫受体链的重组核酸的克隆型谱的
方法，所述方法包括以下步骤：
(a)从个体获取包含T细胞和/或B细胞和/或无细胞DNA的样本；
(b)将序列标签附接到来自所述样本的T细胞受体基因或免疫球蛋
白基因的重组核酸分子，以形成标签-核酸缀合物，其中至少一
个重组核酸或其拷贝附接有不同的序列标签；
(c)扩增所述标签-核酸缀合物；
(d)对所述标签-核酸缀合物的样本测序以提供序列读段，所述序列
读段各自具有错误率并且各自包含标签序列和重组核酸序列；
(e)比对具有类似标签序列的序列读段，以形成具有相同序列标签

【专利技术属性】
技术研发人员：T·阿斯布瑞，K·赫特沃尔德，C·科特瓦利瓦勒，M·法哈姆，M·穆尔黑德，L·翁，T·威特科普，J·郑，
申请(专利权)人：适应生物技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US