本发明专利技术说明书描述了N端第5位谷氨酸(E)突变为天冬氨酸(D)的突变型人促肾上腺皮质激素(简称ACTH(E5D))及其制备工艺。在大肠杆菌中表达ACTH(E5D)组氨酸标签融合蛋白以后，经过Ni柱初步纯化，肠激酶切除多余氨基酸序列，以及凝胶过滤方法制备。体内外实验表明，ACTH(E5D)在血液中的稳定性高于野生型ACTH，并且在相同剂量和相同给药时间条件下的生理活性与野生型ACTH相当。
【技术实现步骤摘要】
所属
本专利技术采用基因工程、分子生物学等方法，制备出保留了人促肾上腺皮质激素(ACTH)促进糖皮质激素产生的作用并且在血液中不易被代谢的基因重组长效ACTH。
技术介绍
血液当中存在多种降解蛋白质的酶类，天然存在的野生型人ACTH的体内半衰期很短，只有约15分钟。ACTH在血液中的降解主要是由血液中的蛋白酶引起的，我们在分析ACTH结构当中的血液蛋白酶降解位点的基础上，构建了野生型以及定点突变的多种ACTH-pET30a原核表达质粒，从中筛选出不易被蛋白酶降解的ACTH点突变体。ACTH是一种多肽，分子量只有4.5kD，在工程菌中不易单独表达纯化；所以我们在ACTHcDNA的5’端连接一段编码6个组氨酸的组氨酸标签(HisTag)以及一段多肽连接物(简称Linker，核苷酸序列共计144bp，表达5.3kD的多肽)的核苷酸序列，表达的融合蛋白不但可以抑制发酵阶段降解，同时提高ACTH在裂解液中的溶解度，还可以用Ni柱初步纯化带有组氨酸标签的蛋白。为了在多肽表达以后去除组氨酸标签，我们在HisTag-Linker与ACTH序列之间加入一段肠激酶(EK)底物“天冬氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸－天冬氨酸－赖氨酸(DDDDK)”的编码核苷酸序列(简称EKst)。这样得到的融合序列简称为“HisTag-Linker-EKst-ACTH(融合核苷酸序列共计285bp，表达的融合蛋白约10.6kD)”。因为肠激酶的切割位点恰好在DDDDK氨基酸序列之后，工程菌中表达出来的带有组氨酸标签的ACTH融合蛋白在基因重组肠激酶(recombinantEK)的作用下可以去除全部的HisTag-Linker肽链和DDDDK序列，得到不带有多余氨基酸残基的ACTH多肽。采用柱层析方法分离纯化出野生型以及各种点突变的ACTH多肽以后，通过动物体内实验以及小鼠肾上腺皮质瘤Y1细胞体外实验，筛选出保留ACTH促进糖皮质激素产生作用并且在血液中不易被代谢的基因重组长效人ACTH。经过与野生型人ACTH对比，我们发现：ACTH的第5位谷氨酸突变为天冬氨酸(E5D)不但可以保留天然ACTH的生物学活性，而且在血液中比野生型更加稳定，可以作为长效ACTH应用。本专利说明书描述一种保留了天然ACTH促进糖皮质激素产生作用的在血液中不易被代谢的突变型ACTH(E5D)及其制备工艺。
技术实现思路
1.专利技术的目的制备高纯度的、保留了天然ACTH促进糖皮质激素产生的生物活性的、在血液中不易被降解的基因重组长效人促肾上腺皮质激素(ACTH)。2.专利技术的技术方案见附图1。3.专利技术的有益效果本专利技术所制备的基因重组长效人ACTH，因其不但具备天然野生型ACTH的生物学活性而且在血液中降解较慢，所以可以降低患者接受ACTH注射给药的剂量和次数，降低成本。另外，医药市场上现有流通的ACTH是从猪的脑垂体中提取，可能携带动物病毒。本专利技术所采用的基因工程制备方法，不但可以获得高纯度的基因重组长效人ACTH，并且在制备过程当中不使用动物材料，所以基本上消除了传播动物病毒的隐患。具体实施方式1.ACTH突变体的设计、原核表达体系构建以及及表达纯化1.1ACTH突变体的设计ACTH的活性区域是氨基(N)端的1-24肽段，羧基末端的第25-39肽段即使被去除或代谢掉依然具有活性，所以我们针对ACTH的1-24肽段设计点突变位点，不但要使其不易被血液中的蛋白酶降解，还要保留ACTH的活性。我们利用CutDB蛋白酶数据库分析了人ACTH中可能的酶切位点(见表1)，在此基础上设计了多种氨基酸点突变ACTH多肽，包括本专利技术专利所描述的第5位谷氨酸突变为天冬氨酸的ACTH(E5D)。(参见“说明书核苷酸和氨基酸序列表”)表1.ACTH中的血液蛋白酶切割位点1.2ACTH原核表达体系的构建及其表达纯化我们表达了野生型(WT)ACTH、ACTH24(具有活性的氨基末端1-24肽段)以及人工设计的ACTH(E5D)，后者与野生型仅相差1个氨基酸，采用同样的表达和分离纯化方法进行制备，具体如下：1.2.1构建表达载体一方面，用BamH1、Sal1双酶切携带组氨酸标签(HisTag)的pET30a空白质粒；另一方面以ACTH为模版，设计分别包含上述两个酶切位点以及EKst核苷酸序列的引物，PCR扩增出结构为“BamH1酶切位点-EKst-ACTH-Sal1酶切位点”的融合片段，然后用BamH1、Sal1双酶切。用T4连接酶将切得片段EKst-ACTH连接到前述切开的pET30a质粒上，构建出HisTag-Linker-EKst-ACTH-pET30A质粒(其中的Linker是HisTag与ACTH之间的连接序列，核苷酸序列长度为123bp，表达出的Linker肽链包含41个氨基酸)。ACTH(E5D)表达质粒的构建，是以构建好的ACTH(WT)质粒为模板，利用引入突变位点的引物，用重叠PCR的方法扩增出E5D突变目的片段，再按照前述方法将其连接到pET30a载体上。构建好的HisTag-Linker-EKst-ACTH-pET30A全质粒环形示意谱图如附图2a所示；BamH1及Sal1双酶切鉴定结果参见附图2b。构建好的ACTH(WT)及ACTH(E5D)的测序结果参见附图3及附图4。在上述实验中所用到的扩增引物如表2所示。表2.PCR扩增引物表1.2.2诱导表达将构建好的载体采用热转化的方法(42℃，45秒)导入BL21-DE3工程菌株。37℃恢复1h后接种到LB培养板上，37℃培养过夜后挑取单克隆菌落，接种到250mLLB培养基中，37℃振荡培养至OD值为0.4～0.6之间时，加入1mM的IPTG，并将温度降至25℃诱导表达8h。1.2.3菌体破碎菌液在10000rpm，4℃下离心15min，弃去上清，加入菌体漂洗液(10mMTris-HCl，10mMEDTA，100mMNaCl)洗涤三次。按照每克湿菌加10ml裂解液的比例，加入菌体裂解液(50mMTris-Cl，300mMNaCl，10mM咪唑，1mMPMSF，pH8.0)。因为N末端的HisTag-Linker提高了ACTH的溶解度，表达的ACTH主要存在于裂解液的上清液当中，所以12000rpm离心15min后，弃去包涵体沉淀，保留上清液用于下一步分离。1.2.4分离纯化1.2.4.1Ni柱纯化Ni柱用2倍柱体积20％乙醇清洗，再用2倍柱体积去离子水冲洗。更换流动相为平衡缓冲液(50mMTris-HCl、300mMNaCl、10mM咪唑，pH8.0)，平衡5个柱体积。加样后，更换流动相为漂洗液(50mMTris-Cl、300mMNaCl、30mM咪唑，pH8.0)，漂洗20个柱体积。更换流动相为洗脱液(50mMTris-Cl、300MmNaCl、250mM咪唑，pH8.0)，弃去最初3mL洗脱液后，收集洗脱组分，每管1mL，收集10管，洗脱组分当中的ACTH融合蛋白条带如附图5所示。<本文档来自技高网...
【技术保护点】
采用本专利所应用的基因工程方法制备促肾上腺皮质激素（ACTH），包括野生型及突变型。
【技术特征摘要】
1.采用本专利所应用的基因工程方法制备促肾上腺皮质激素（ACTH），包括野生型及突变型。
2.采用本专利所描述的氨基酸定点突变，获得的具有生物活性的ACTH突变体。
3.采用本专利所描述的氨基酸定点突变，获得的在血液中不易被代谢的ACTH突变体。
4....
【专利技术属性】
技术研发人员：王大勇，黄永林，裴业春，
申请(专利权)人：王大勇，黄永林，裴业春，
类型：发明
国别省市：海南;46
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