本发明专利技术涉及一个参与DMNT和TMTT生物合成的CYP450基因及其编码产物与应用，属于植物分子生物领域，本发明专利技术提供的蛋白如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术得到立马豆PlCYP82的cDNA核酸序列及PlCYP82编码蛋白序列；在酵母WAT21细胞中表达的PlCYP82蛋白具有催化(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇的活性；采用浸花法获得转PlCYP82基因拟南芥，结果表明转PlCYP82的拟南芥植株可显著吸引小菜蛾绒茧蜂雌虫。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物分子生物学领域，特别涉及DMNT和TMTT化合物合成相关的蛋白，编码其的基因及其应用。
技术介绍
在植物的众多化合物中，有一些是挥发性物质。植物挥发物在植物抵御虫害的过程中发挥着重要的作用。当植物受到害虫的危害之后，植物会感知到，并通过合成释放挥发性物质来趋避害虫或引诱植食性昆虫的天敌来减轻害虫危害，从而提高植物的抗虫性。萜烯类挥发物包括单萜类，倍半萜类，二萜类和萜烯同系物(E)-4，8-二甲基-1，3，7-壬三烯((E)-4，8-dimethyl-1，3，7-nonatriene，DMNT)和(E，E)-4，8，12-三甲基-1，3，7，11-十三碳四烯((E，E)-4，8，12-trimethyltrideca-1，3，7，11-tetraene，TMTT)等。DMNT和TMTT是植物花香挥发物和害虫诱导挥发物中最常见的一类，这两种物质在单子叶植物和双子叶植物中广泛存在，包括杨树和胡桃树等树种，还有玉米、拟南芥、棉花、利马豆、黄瓜、番茄和大白菜等作物。DMNT和TMTT在生态系统能吸引多种害虫的寄生性天敌和捕食性天敌，如智利小植绥螨、微红盘绒茧蜂和盔奥啮小蜂等。此外，DMNT和TMTT能诱导或预警未被危害的邻近植物或同一植物内的防御反应。DMNT和TMTT的前体分别为(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇。但是，把橙花叔醇和香叶基芳樟醇转化为DMNT和TMTT的关键酶很久都未解决。氘标记的代谢物探针研究表明叔醇通过碳碳骨架沟的氧化反应而形成萜烯同系物。通过拟南芥的共表达数据库鉴定出一批在多种压力胁迫下与香叶基芳樟醇合成酶基因共表达的P450基因，该方法结合对诱导处理叶片的RT-PCR研究，鉴定到一个候选的P450基因。通过酵母表达和对拟南芥突变体株系的回补实验研究，发现植物的CYP82家族成员CYP82G1(At3g25180)负责着拟南芥TMTT的合成。CYP450酶为血红蛋白结合蛋白，在所有已知的CYP450酶中都存在一个保守的血红素结合域，是鉴定该基因的一个重要特征。拟南芥基因组中有272个CYP450基因，拟南芥基因组注释显示有457个CYP450基因，如此庞大的基因家族反映了植物次生代谢物的复杂多变。各种CYP450酶催化的反应广泛并且复杂，包括羟基化、N-、0-和S-端的脱烷基化、环氧基化、脱氨基作用、脱硫、脱卤作用和过氧化反应等。尽管催化反应各异，催化机理却相同，即通过NADPH或者NADH为CYP450传递电子，激活氧分子，将其中的一个氧插入到底物上，同时生成一分子水。CYP450酶作为萜类、黄酮类、脂肪酸类和植物激素等合成代谢途径的一类重要酶蛋白，不但催化相关代谢反应，由于大多数的CYP450蛋白均有一段内质网膜定位蛋白，因此在代谢区室(Metabolon)的酶复合体中还具有固定酶复合体的作用。随着分子生物学以及相关检测技术的不断发展，次生代谢途径相关的CYP450基因功能逐渐得以验证。真核表达、原核表达以及RNA干扰(RNAInterference)等技术在CYP450基因的功能验证中发挥了重要作用。近年来利用真核表达使得CYP450酶在紫杉酚、青蒿素、植物挥发物等代谢途径中的重要作用逐渐被解析。但是作为在植物次生代谢中发挥作用的CYP450表达量相对较低，并且大多CYP450蛋白具有严格的催化底物结构特异性，同时基因组中广泛存在的CYP450基因为次生代谢相关基因的克隆和功能验证提供了难度，使之成为了近年来国际学术界的研究热点之一。到目前为止DMNT和TMTT合成通路只有在拟南芥中被解析。在其他物种中的研究尚停留在化合物鉴定和行为学研究方面，尚未有DMNT和TMTT合成通路基因被报道。特别是在农业生产中重要的植物，如蔬菜和农作物等方面的研究更为有限，这限制了我们对于DMNT和TMTT合成通路的认识，也限制了DMNT和TMTT在绿色农业生产中的应用。这极大的限制了DMNT和TMTT在农作物中的应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一个立马豆DMNT和TMTT生物合成代谢途径的CYP450基因PlCYP82，其编码的蛋白在含有NADPH的缓冲体系中能催化(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇生成DMNT和TMTT。本专利技术提供了一种与DMNT和TMTT合成代谢有关的基因PlCYP82，它是序列表中SEQIDNo:1所示的DNA序列。以及一种由上述基因CYP450编码的蛋白质，具有序列表中SEQIDNo:2的氨基酸残基序列以及具有SEQIDNo.2的氨基酸残基序列相同活性的由SEQIDNo.2衍生的蛋白质。本专利技术SEQIDNo.1的DNA序列由1713个碱基组成，其中71-1657的碱基编码528个氨基酸残基组成的蛋白质序列SEQIDNo.2。含有本专利技术基因PlCYP82的表达载体、细胞系及宿主菌和使用该基因在调节和生产植物DMNT和TMTT化合物及植物抗虫育种中的应用也在本专利技术的保护范围之内。将SEQIDNo.1基因克隆到真核表达载体PYES2的限制性内切酶BamHI和NheI位点间，构建带有PlCYP82基因的重组表达载体pESC-TRP-PlCYP82；转入酵母菌株WAT21表达宿主菌采用半乳糖诱导表达。通过提取表达菌株微粒体，加入到以(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇为底物的体外酶促反应体系中，正己烷萃取反应产物，GC-MS分析。GC-MS分析结果表明(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇在PlCYP82蛋白酶的催化下，生成了新的物质，通过分析新产物的分子离子峰与DMNT和TMTT标样对比，认为该产物为DMNT和TMTT。研究结果表明，本专利技术与立马豆DMNT和TMTT合成有关的基因具有细胞色素P450基因的特征结构域，酶促反应分析发现该基因催化(E)-橙花叔醇和(E,E)-香叶基芳樟醇形成防御性挥发物DMNT和TMTT，对于调节和生产植物DMNT和TMTT挥发物及培育新的抗虫作物具有重要的理论及实际意义。附图说明图1.立马豆PlCYP82基因的PCR克隆M：DNA分子量标准(D2000)；P：PCR产物图2.重组质粒pESC-TRP-PlCYP82的PCR鉴定M：DNA分子量标准(D2000)；P：PCR产物图3.利马豆PlCYP82基因在酵母中反应产物的GC-MS图PlCYP82基因以(E)-Nerolidol和(E,E)-Geranyllinalool为底物的酵母反应产物(A和C)；空载体以(E)-Nerolidol和(E,E)-Geranyllinaloo本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个参与DMNT和TMTT生物合成的CYP450基因蛋白,其具有如SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
1.一个参与DMNT和TMTT生物合成的CYP450基因蛋白,其具有如SEQIDNO2所示
的氨基酸序列。
2.权利要求1所述的蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，具有如SEQIDNO1所示核苷酸序列或SEQIDNO1
中第71-1657的核苷酸序列。
4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体或转基因细胞系或重组菌。
5.权利要求4所述的重组载体，为将权利要求2或3所述的编码基因插入到表达载体中，
得到表达所述蛋白的重组载体。
6.根据权利要求5所述的重组载体，所述编码基因具有SEQIDNO1所述的序...
【专利技术属性】
技术研发人员：王桂荣，李峰奇，杨婷，刘杨，
申请(专利权)人：中国农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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