云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP‑OA3及其制备方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP‑OA3及其制备方法与应用，该抗氧化多肽AOP‑OA3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP‑OA3制备方法可从云南臭蛙皮肤分泌物种分离纯化获得。本发明专利技术从中国产云南臭蛙的皮肤中得到了1个新颖的抗氧化多肽AOP‑OA3，其抗氧化活性很强，约为维生素E的280倍。将本发明专利技术的云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP‑OA3全序列结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医学领域，具体地说，涉及一种云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3及其制备方法与应用。
技术介绍
抗氧化剂是阻止氧气不良影响的物质，它是一类能帮助捕获并中和自由基，从而祛除自由基对人体损害的一类物质。目前已经发现了大量的抗氧化剂，这些抗氧化剂可以被分为以下两大类：1)非基因编码的小分子无助，如维生素E、维生素C、谷胱甘肽等；2)基因编码的大分子物质，如超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、硫氧还蛋白等。这些抗氧化剂已经被广泛应用于各种领域，包括健康、食品、化妆品及各种工业中，比如作为燃料和润滑剂的稳定剂防止氧化，也可加在汽油中起到防止聚合从而避免引擎积垢形成的目的，单在2007年，工业用途的抗氧化剂的就创造了大约37亿美元的收入。基于抗氧化剂的重要性，科学家们一直在孜孜不倦的寻找着新型抗氧化剂。两栖动物是水生动物过度到陆生动物之间的重要类群，其皮肤裸露，表面没有毛发覆盖，直接面对各种生存压力，承当着诸多重要的生物学功能，比如抵御微生物入侵、体色调节、水盐平衡调节等。已经有大量的研究证据表明，两栖动物的皮肤能分泌大量的活性物质(主要是蛋白和多肽)使得其能完成这些重要的生物学功能。最近，在两栖动物滇蛙的皮肤中发现了一类新型的抗氧化剂，其化学本质为多肽，和传统的两大类抗氧化剂不同，其由基因编码，但分子量却很小。此后，在一些两栖动物皮肤中也发现了这一类物质，但和传统的抗氧化剂相比，我们对这一类新型抗氧化剂的结构和功能了解还知之甚少。云南臭蛙是中国特有的一种两栖动物，广泛分布于强紫外照射的云贵高原，根据其生境，我们推测其皮肤能分泌高效的新型抗氧化多肽使得其能抵御紫外照射所造成的伤害。对这些多肽的挖掘、结构和功能的研究一方面为我们理解两栖动物适应高海拔强紫外照射生境提供新的分子线索，另外一方面能为我们提供新的、具有自主知识产权的抗氧化剂。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术针对上述的问题，提供了一种云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3及其制备方法与应用，制备得到的云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3具有结构新颖、简单、活性强的特点。为了解决上述技术问题，本专利技术公开了一种云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3，抗氧化多肽AOP-OA3的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术还公开了一种上述云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3的制备方法，包括以下步骤：1)原料预处理：取云南臭蛙皮肤分泌物，溶解于质量浓度为0.9％的生理盐水，真空冷冻干燥浓缩至干粉，-80℃保存备用；2)SephadexG50分子筛：将步骤1)中制备得到的云南臭蛙皮肤分泌物冻干粉溶解于去离子水中，上SephadexG50柱子，用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为2.0毫升/10分钟，每10分钟收集一管，测定其在280纳米下的吸光度，收集合并具有抗氧化活性的洗脱峰；3)高效液相色谱反相层析：将步骤2)中制备得到的洗脱液上样于HypersilODS2柱子，实验仪器为Waters1525高压液相系统，在流速为1毫升/分钟的条件下，用乙腈在线性梯度条件下进行洗脱，监测波长为215纳米，收集合并具有抗氧化活性的洗脱峰，浓缩干燥后得到目标物。进一步地，步骤2)中的SephadexG50柱子预先用20mM、pH6.8、含0.1MNaCl的Tris-HCl缓冲液平衡24h。进一步地，步骤3)中的HypersilODS2色谱柱需预先用含0.1％三氟乙酸的超纯水平衡。进一步地，步骤3)中的乙腈为含0.1％三氟乙酸的乙腈。进一步地，步骤3)中的线性梯度洗脱具体为：乙腈浓度从0％升至60％所消耗的时间为60分钟。本专利技术还公开了一种上述的云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3在制备与抗氧化相关的药物、保健品、化妆品中的应用。与现有技术相比，本专利技术可以获得包括以下技术效果：1)本专利技术从中国产云南臭蛙的皮肤中得到了1个新的抗氧化多肽AOP-OA3，其抗氧化活性很强，约为维生素E的280倍。将本专利技术的云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3全序列结构经蛋白质数据库进行搜寻比较，未发现有任何相同多肽。2)云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3具有结构简单、抗氧化活性强的特点。3)纯化得到的云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3在自由基ABTS+清除实验中显示了较强的抗氧化活性，揭示本专利技术云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3有潜在的应用前景。当然，实施本专利技术的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。附图说明此处所说明的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，构成本专利技术的一部分，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1为本专利技术云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3的G50分子筛层析图；图2为本专利技术云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3的HPLC反相C18柱层析图，其中，3代表AOP-OA3峰；图3为本专利技术分离纯化云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3的自由基ABTS+清除活性图。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本专利技术的实施方式，藉此对本专利技术如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1：云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3分离纯化和鉴定1、分离纯化云南臭蛙活体采自云南保山，取其皮肤分泌物(溶解于质量浓度为0.9％的生理盐水，这能最大化保持其生物学活性)，真空冷冻干燥浓缩至干粉，-80℃保存备用。第一步：SephadexG50分子筛：按照上述方法获得皮肤分泌物冻干粉，溶解于去离子水中，取1毫升(蛋白与多肽总含量为100毫克)上预先用20mMTris-HCl缓冲液(pH＝6.8，含0.1MNaCl)平衡24小时的SephadexG50(GEHealthcare，超细)柱子(长度40厘米，内径宽度1.5厘米)，用同样的缓冲液进行洗脱，流速为2.0毫升/10分钟，每10分钟收集一管，测定其在280纳米下的吸光度，所得的分离纯化图谱如图1所示，其中AOP-OA3存在于图所示峰。第二步：高效液相色谱反相层析：第一步所得样品上样于预先用超纯水(含体积浓度为0.1％的三氟乙酸)平衡好的HypersilODS2柱子(伊利特，尺寸为4.6毫米×300毫米)，实验仪器为Waters1525高压液相系统，在流速为1ml/min的条件下，用乙腈(含0.1％的三氟乙酸)在在线性梯度(0-60％，60分钟)条件下进行洗脱，监测波长为215纳米，所得的分离纯化图谱如图2所示，图中“3”所示为纯化的天然云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3。2、分子鉴定氨基酸序列的测定：纯化得到的云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3在全自动蛋白质序列测定仪(岛津PPSQ-31A)上经Edman降解法，测定了云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3氨基酸全序列，结果表明云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3具有本专利技术SEQIDNO:1所示的结构。实施例2：云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3的抗氧化活性本专利技术利用自由基ABTS+清除活性实验检测拉云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3的抗氧化活性，结果表明云南臭蛙皮肤抗氧化肽AOP-OA3具有较强的抗氧化活性7mM的ABTS在水中和2.8mM的过硫酸钾混合，室温黑暗环境中反应6个小时，使得ABTS被氧化成为ABTS+自由基，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP‑OA3，其特征在于，所述抗氧化多肽AOP‑OA3的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3，其特征在于，所述抗氧化多肽AOP-OA3的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种如权利要求1所述的云南臭蛙皮肤抗氧化多肽AOP-OA3的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：1)原料预处理：取云南臭蛙皮肤分泌物，溶解于质量浓度为0.9％的生理盐水，真空冷冻干燥浓缩至干粉，-80℃保存备用；2)SephadexG50分子筛：将步骤1)中制备得到的云南臭蛙皮肤分泌物冻干粉溶解于去离子水中，上SephadexG50柱子，用Tris-HCl缓冲液进行洗脱，流速为2.0毫升/10分钟，每10分钟收集一管，测定其在280nm下的吸光度，收集合并具有抗氧化活性的洗脱峰；3)高效液相色谱反相层析：将步骤2)中制备得到的洗脱液上样于HypersilODS2柱子，实验仪器为Waters1525高压液相系统，在流速为1毫升/分钟的条件下，用乙腈在线性梯度条件下进行洗脱，监测波长为215纳...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨新旺，李小洁，唐璟，王滢，
申请(专利权)人：昆明医科大学，
类型：发明
国别省市：云南;53