本发明专利技术公开了一种甘蔗叶片中柠檬酸含量的HPLC检测方法，包括以下步骤：S1.将待测的甘蔗叶片加入液氮磨碎，再加入70~90%的甲醇水溶液研磨成浆，2~5℃浸提，超声提取，离心，取上清液，残渣再加入70~90%甲醇水溶液超声提取，离心后取出上清液，重复残渣浸提和离心操作1~3次，合并上清液，用70~90%甲醇定容，过滤；S2.采用HPLC检测样品溶液中柠檬酸的含量。本方法能准确检测出甘蔗叶片中柠檬酸含量，为判断甘蔗品种对梢腐病感抗差异研究和柠檬酸介导甘蔗梢腐病病原菌胁迫应答生化机制提供科学有力的检测技术。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及甘蔗内源激素检测
，特别是一种甘蔗叶片中柠檬酸含量的HPLC检测方法。
技术介绍
甘蔗（Saccharumofficinarum)是我国最重要糖料作物，蔗糖占我国食糖总产92%。甘蔗中含有的植物激素几乎参与了其生长发育所有过程的生理调节，从细胞的生长分裂和分化，到种子的休眠、果实发育、性别分化和衰老过程等。对于甘蔗而言，它有2个非常重要的指标直接影响着甘蔗的经济价值，分别糖分和产量，但如果甘蔗受到病虫害影响而不能及时发现，则会大大影响甘蔗的糖分和产量。如果能够通过研究甘蔗生长过程中内源激素的变化趋势，判断甘蔗品种感染病原后的感抗差异，并建立对应病原菌胁迫应答的生化机制，那么将对甘蔗经济价值的增长具有重大的现实意义。甘蔗梢腐病最早是在印尼首先发现的，并随甘蔗品种POJ2878及其衍生品种的推广蔓延至全世界，其发病最高级和严重阶段，会导致蔗株心叶整个基部腐烂和快速失水，最终在甘蔗梢部幼嫩组织上形成顶腐状，从而造成产量和糖分损失。尤其近年，云南、广西蔗区种植的桂糖11号、GT21号和主推的桂糖37号多为感病品种，ROC22以及ROC16等主栽品种感染梢腐病程度也日益严重，这给糖业安全生产带来了严重影响。甘蔗在受到梢腐病病原侵染时，会产生一系列的防御反应来保护自己。在与病原菌的互作过程中，蔗株内源激素的含量和活性发生变化，由此影响甘蔗正常生理生化进程，从而感染甘蔗并导致发病。因此，对感染梢腐病病原后的内源激素变化趋势研究是十分紧迫的问题。柠檬酸作为逆境信号物质，以内源激素为正负信号对体内各种代谢进行有效调控，不仅与可溶性蛋白合成及提高羧基歧化酶、蔗糖转运酶活性等有关，且与提高植物光合能力，增强植物生长势、植物激素物质的合成密切相关。但至今尚无建立高效、精确的甘蔗叶片柠檬酸含量检测方法，鉴于此建立一套快速有效的甘蔗叶片柠檬酸含量检测方法，对及时判断甘蔗品种感染病原后的感抗差异和研究柠檬酸内源激素介导甘蔗梢腐病病原菌胁迫应答的生化机制具有非常重要的意义。
技术实现思路
针对我国甘蔗叶片柠檬酸含量检测方法的空白，本专利技术的目的在于提供一种简便、快速、准确的甘蔗叶片中柠檬酸含量的HPLC检测方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方法如下：一种甘蔗叶片中柠檬酸含量的HPLC检测方法，其特征在于包括以下步骤：S1.将待测的甘蔗叶片加入预冷至2~5℃的体积分数为70~90%甲醇水溶液，再加入液氮研磨成浆，定容，2~5℃浸提50~90min，超声提取1.5~3h，离心，取上清液，残渣再加入预冷至2~5℃体积分数为70~90%甲醇水溶液超声提取20~40min，离心后取出上清液，重复残渣浸提和离心操作0~3次，合并上清液，用70~90%甲醇定容，过滤，作为样品溶液备用；S2.采用HPLC检测样品溶液中柠檬酸的含量。进一步的，所述步骤S2中，HPLC色谱条件为：采用C18反相色谱柱；流动相由12.5mmol/L的磷酸二氢钠水溶液与甲醇按体积比50:1混合，再加入0.5mol/L的磷酸水溶液调节pH至2.8；柱温为32~38℃，流速0.8~1.2mL/min，紫外检测波长214nm。更进一步的，所述步骤S6中，HPLC色谱条件为：柱温为35℃，流速0.8mL/min，进样量10μL。进一步的，所述步骤S1中，所述待测的甘蔗叶片预先从甘蔗上置于冰盒上剪下。进一步的，所述步骤S1中，待测的甘蔗叶片和残渣浸提采用的是体积分数为80%的甲醇水溶液。进一步的，所述步骤S1中，待测的甘蔗叶片和残渣浸提的温度为4℃。进一步的，所述步骤S1中，甘蔗叶片研磨成浆后，加入超净水进行定容。进一步的，所述步骤S5中，过滤采用针头式过滤器进行。本专利技术还提供了以上所述的检测方法在判断甘蔗品种对梢腐病感性和抗性差异方面的应用。本专利技术的有益效果是：1）样品前处理方法采用浸泡和超声提取相结合的方法提取柠檬酸，与其他方法相比，提取快速，提取有效成分完全，除杂效果好，待测样品纯净度高。2）通过本专利技术HPLC色谱条件测量样品溶液中柠檬酸的含量，柠檬酸能与其他有效成分较好地进行分离，且检测速度快，重复性和准确性好，在具备高效液相色谱仪的实验室均能通过此法开展柠檬酸含量检测工作。3）本专利技术尤其适用于感染梢腐病的甘蔗叶片中柠檬酸含量的测定，通过上述样品的前处理方法和色谱条件，能排除梢腐病病原菌对检测结果的干扰，从而为判断甘蔗品种对梢腐病感抗差异研究和柠檬酸介导甘蔗梢腐病病原菌胁迫应答生化机制提供科学有力的检测技术；同时，本专利技术方法的推广使用，对于筛选抗病品种和指导甘蔗抗病育种也具有重要意义和现实作用。附图说明图1为柠檬酸的标准工作曲线。图2a为标准溶液检测得到的色谱图。图2b为样品溶液检测得到的色谱图。图3为不同生长阶段甘蔗样品中柠檬酸的含量的趋势分析图。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术作进一步详细的阐述，但本专利技术的实施方式并不局限于实施例表示的范围。这些实施例仅用于说明本专利技术，而非用于限制本专利技术的范围。此外，在阅读本专利技术的内容后，本领域的技术人员可以对本专利技术作各种修改，这些等价变化同样落于本专利技术所附权利要求书所限定的范围。实施例1甘蔗叶片中柠檬酸含量的HPLC检测方法S1.选取感染甘蔗梢腐病病原的甘蔗叶片作为待测样品，取待测样品2g，加入4mL预冷至4℃的体积分数为80%的甲醇水溶液，加入液氮研磨成浆，用超净水定容至10ml，4℃浸提1h，超声提取2h，10000r/min离心10min，取上清液，残渣再加入2mL预冷至4℃的体积分数为80%甲醇水溶液超声提取30min，10000r/min离心10min，离心后取出上清液，合并上清液，用体积分数为80%甲醇水溶液定容至8mL，取适量定容后的溶液用针头式过滤器过滤于带有内衬管的样品瓶内，作为样品溶液备用；S2.采用HPLC检测样品溶液中柠檬酸的含量。S2-1.色谱条件：ARigolL3000高效液相色谱仪；色谱柱：CSTC18反相色谱柱（250mm*4.6mm,5μm）；流动相：12.5mmol/L的磷酸二氢钠水溶液800mL，加入16mL甲醇，用0.5mol/L的磷酸水溶液调节溶液pH至2.8，混匀；柱温：35℃；流速：0.8mL/min；检测波长：214nm；进样体积：10μL。S2-2.称取柠檬酸标准品2.5mg，加入10mL水溶解，配置成250μg/mL的标准溶液母液；然后用标准溶液母液再一次稀释成浓度分别为50μg/mL、25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL的标准溶液，采用S2-1的色谱条件检测标准溶液母液和标准溶液，其对应峰面积分别为236.008、5.439、23.503、8.295、4.745、0.755；然后以峰面积为纵坐标、以柠檬酸浓度为横坐标做标准曲线，标准曲线如图1所述，由图1可见，在所检测范围内(1μg/mL～250μg/mL)，回归方程式为y=0.9448x-0.4263，液相色谱峰面积与柠檬酸浓度具有良好的线性关系(R2=0.9996)。S2-3.专属性考察：分别取10μL的250μg/mL标准溶液母液和样品溶液注入液相色谱仪中，采用S2-1的色谱条件检测，标准溶液母液中柠檬酸的保留时间为8.747min本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甘蔗叶片中柠檬酸含量的HPLC 检测方法，其特征在于包括以下步骤：S1.将待测的甘蔗叶片加入预冷至2~5℃的体积分数为70~90%甲醇水溶液，再加入液氮研磨成浆，定容，2~5℃浸提50~90min，超声提取1.5~3h，离心，取上清液，残渣再加入预冷至2~5℃体积分数为70~90%甲醇水溶液超声提取20~40min，离心后取出上清液，重复残渣浸提和离心操作0~3次，合并上清液，用70~90%甲醇定容，过滤，作为样品溶液备用；S2.采用HPLC检测样品溶液中柠檬酸的含量。
【技术特征摘要】
1.一种甘蔗叶片中柠檬酸含量的HPLC检测方法，其特征在于包括以下步骤：S1.将待测的甘蔗叶片加入预冷至2~5℃的体积分数为70~90%甲醇水溶液，再加入液氮研磨成浆，定容，2~5℃浸提50~90min，超声提取1.5~3h，离心，取上清液，残渣再加入预冷至2~5℃体积分数为70~90%甲醇水溶液超声提取20~40min，离心后取出上清液，重复残渣浸提和离心操作0~3次，合并上清液，用70~90%甲醇定容，过滤，作为样品溶液备用；S2.采用HPLC检测样品溶液中柠檬酸的含量。2.根据权利要求1所述的甘蔗叶片中柠檬酸含量的HPLC检测方法，其特征在于：所述步骤S2中，HPLC色谱条件为：采用C18反相色谱柱；流动相由12.5mmol/L的磷酸二氢钠水溶液与甲醇按体积比50:1混合，再加入0.5mol/L的磷酸水溶液调节pH至2.8；柱温为32~38℃，流速0.8~1.2mL/min，紫外检测波长214nm。3.根据权利要求2所述的甘蔗叶片中柠檬酸含量的HPL...
【专利技术属性】
技术研发人员：王泽平，李长宁，刘璐，张保青，杨翠芳，高轶静，蒋洪涛，罗霆，梁强，林善海，段维兴，张革民，周珊，韦金菊，
申请(专利权)人：广西壮族自治区农业科学院甘蔗研究所中国农业科学院甘蔗研究中心，
类型：发明
国别省市：广西;45
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