一种基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA的文库构建方法、试剂及其应用技术

本发明专利技术公开了一种基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA的文库构建方法、试剂及其应用，构建过程包括血液游离DNA提取、末端修复、片段选择、接头连接、磁珠纯化、文库扩增、文库检测、高通量测序等步骤。本发明专利技术还提供一种用于构建基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA文库的血液游离DNA提取试剂、末端修复试剂、接头连接反应试剂、扩增试剂。本发明专利技术明显提高了孕妇血浆胎儿游离DNA的提取浓度，且步骤简单，成本低，提高了建库的成功率；优化后的文库构建体系更利于操作，节省成本，且更换磁珠后，纯化回收效率更高；文库扩增也不需凑够样本量和二次检测，操作更加简单。本发明专利技术方法更适用于胎儿染色体非整倍体无创产前诊断。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及高通量测序领域，具体是一种基于IonProtonTM测序平台的血液游离DNA的文库构建方法、试剂及其应用。
技术介绍
据美国2006年的出生缺陷全球报告统计全球每年至少新增出生缺陷790万例，占出生人口的6％，而我国又是出生缺陷的高发国，目前出生缺陷发生率约5.6％，每年新增出生缺陷约90万例。有报告显示，我国严重出生缺陷患儿中除30％经早期诊断治疗可正常生活，约30％在出生后死亡，40％将成为终生残疾，不仅给家庭造成严重经济负担，同时也给家庭带来严重的心理负担和精神痛苦，此外给国家和社会的经济发展也造成了沉重的负担。据统计，我国每年出生缺陷患儿的治疗费用高达数百亿元，维持基本的生活费用高达数百亿元，给国家带来了约数千亿元的间接费用。出生缺陷是指婴儿在出生之前，在母体子宫里就发生的发育异常以及存在于身体某些部位的畸形。这些缺陷大多是由各种各样的遗传病引起的。遗传病的种类大致可分为三类：单基因遗传、多基因遗传病、染色体病。由于染色体病累及涉及的基因数目较多，故症状通常更严重。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于Ion ProtonTM测序平台的血液游离DNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)血液游离DNA提取：采用磁珠法提取样品中的血液游离DNA；(2)末端修复：将步骤(1)所得到的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA；(3)片段选择：利用磁珠对步骤(2)所得到的平末端DNA进行片段大小筛选并进行磁珠纯化；(4)接头连接：将步骤(3)所得到的DNA片段与接头连接反应试剂、接头、标签接头混合进行接头连接反应；(5)磁珠纯化：将步骤(4)所得到的反应产物利用磁珠进行纯化；(6)文库扩增：将步骤(5)纯化后的DNA片段加入扩增试剂和扩增引物进行PCR扩增，再利用磁珠进行纯化，得到血...

【技术特征摘要】
1.一种基于IonProtonTM测序平台的血液游离DNA文库构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)血液游离DNA提取：采用磁珠法提取样品中的血液游离DNA；
(2)末端修复：将步骤(1)所得到的DNA片段进行末端修复，得到平末端DNA；
(3)片段选择：利用磁珠对步骤(2)所得到的平末端DNA进行片段大小筛选并进行磁珠纯化；
(4)接头连接：将步骤(3)所得到的DNA片段与接头连接反应试剂、接头、标签接头混合进行接
头连接反应；
(5)磁珠纯化：将步骤(4)所得到的反应产物利用磁珠进行纯化；
(6)文库扩增：将步骤(5)纯化后的DNA片段加入扩增试剂和扩增引物进行PCR扩增，再利用磁
珠进行纯化，得到血液游离DNA文库；
(7)文库检测：将步骤(6)所得到的血液游离DNA文库采用Qubit和AgilentBioanalyzer2100检测
文库浓度及文库片段大小；
(8)高通量测序：基于IonProtonTM测序平台，将步骤(7)中所得到的不同血液游离DNA文库样
本等浓度混样进行高通量测序；
其中，步骤(1)所述样品为孕12-24周的孕妇血浆；
步骤(1)采用试剂盒提取血液游离DNA，所述试剂盒为血清游离DNA提取试剂盒；
步骤(2)中进行末端修复时所用的末端修复试剂pH值为7.4-7.6，溶剂为水，溶质为：5-15mM的
Tris-HCl缓冲溶液、40-60mM的NaCl溶液、8-12mMMgCl2、2-4mM二硫苏糖醇、8-12mMATP、8-12mM
dNTPs混合液，末端修复酶为8-12U/μl的EndRepair酶；
步骤(3)中所用磁珠为AgencourtAMPureXP磁珠；
步骤(4)中接头连接反应试剂由酶与连接反应缓冲液组成，所述酶为300-500U/μl的T4DNALigase
和6-10U/μl的NickRepairDNAPolymerase；连接反应缓冲液pH值为7.6，溶剂为水，溶质为：pH7.8-8.2、
40-60mM的Tris-HCl缓冲溶液、8-12mM的KCl、8-12mM二硫苏糖醇、0.5-2mM的ATP、1-3nM的dNTPs
混合液、8-12mM的(NH4)2SO4、1-3mM的MgSO4；
步骤(5)中所用磁珠为AgencourtAMPureXP磁珠；
步骤(6)中扩增试剂pH值为7.5-7.7，溶剂为水，溶质为：1-3U/μlPCRSuperMixHigh
Fidelity、pH8.8-9.0的64-68mM的Tris-SO4、15-25mM的(NH4)2SO4、1-3mM的MgSO4、200-250μMdNTPs
混合液；
步骤(6)中所用磁珠为AgencourtAMPureXP磁珠。
2.根据权利要求1所述的基于IonProtonTM测序平台的血液游离DNA文库构建方法，其特征在于，步
骤(1)中的孕妇血浆取自孕妇外周血的血浆，将孕妇血浆4℃下1600g离心15min后，取上清于2ml离
心管中，4℃下16000g离心10min，将孕妇血浆转移至新的离心管中，该孕妇血浆用于后续实验或-80℃冻
存备用。
3.根据权利要求1所述的基于IonProtonTM测序平台的血液游离DNA文库构建方法，其特征在于，其
中步骤(3)筛选片段大小为200-300bp。
4.根据权利要求1所述的基于IonProtonTM测序平台的血液游离DNA文库构建方法，其特征在于，步
骤(4)的接头是由如下正反两个序列组成的P1：
5'CCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGCAGTCGGTGAT3'
5'ATCACCGACTGCCCATAGAGAGGAAAGCGGAGGCGTAGTGGTT3'。
5.根据权利要求1所述的基于IonProtonTM测序平台的血液游离DNA文库构建方法，其特征在于，步
骤(4)中的标签接头是由如下正反两个序列组成的IonXpressBarcodeX：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGNNNNNNNNNNGAT3'
5'ATCNNNNNNNNNNCTGAGTCGGAGACACGC3'。
6.根据权利要求5所述的基于IonProtonTM测序平台的血液游离DNA文库构建方法，其特征在于，Ion
XpressBarcodeX选自：
Barcode1：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCTATTCGTCGAT3'
5'ATCGACGAATAGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
Barcode2：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGAGGCAATTGCGAT3'
5'ATCGCAATTGCCTCTGAGTCGGAGACACGC3'；
Barcode3：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTAGTCGGACGAT3'
5'ATCGTCCGACTAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
Barcode4：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGCAGATCCATCGAT3'
5'ATCGATGGATCTGCTGAGTCGGAGACACGC3'；
Barcode5：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTCGCAATTACGAT3'
5'ATCGTAATTGCGACTGAGTCGGAGACACGC3'；
Barcode6：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTTCGAGACGCGAT3'
5'ATCGCGTCTCGAACTGAGTCGGAGACACGC3'；
Barcode7：
5'CCATCTCATCCCTGCGTGTCTCCGACTCAGTGCCACGAACGAT3'
5'ATCGTTCGTGGCACTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁聪聪，丁志远，叶佳芝，牟晓威，邱宝义，刘明明，陈贤丰，
申请(专利权)人：浙江圣庭生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33