用于对有丝分裂后细胞的疾病和障碍进行靶向和建模的系统、方法和组合物的递送、工程化和优化技术方案

本发明专利技术提供了用于操纵序列和/或靶序列的活性的系统、方法、和组合物的递送、工程化和优化。提供了递送系统和包括有丝分裂后细胞的组织或器官，这些有丝分裂后细胞被靶向作为用于递送的位点。还提供了其中的一些对CRISPR复合物的一种或多种组分进行编码的载体和载体系统、以及用于设计和使用这样的载体的方法。还提供了指导在真核细胞中形成CRISPR复合物的方法，以确保对于靶标识别的增强特异性和避免毒性，并且以编辑或修饰在感兴趣基因组座位中的靶位点以便改变或改善疾病或病症的状态。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】相关应用和引用参考要求来自2013年6月17日提交的美国临时专利申请61/836,123、2013年7月17日提交的61/847,537、2013年8月5日提交的61/862,355、2013年8月28日提交的61/871,301、2013年12月12日提交的61/915,203、2014年4月15日提交的61/979,573、以及2013年12月12日提交的PCT/US2013/074667的用于美国的目的的优先权，本申请也是部分继续申请；并且如可以在美国法律下允许的，美国等效物或到此的国家阶段可以进一步要求和要求对于PCT/US2013/074667的优先权以及PCT/US2013/074667所要求优先权的来源的申请的优先权。前述申请、以及在其中或在它们的审查程序期间引用的所有文献或(“申请引用文献”)以及在这些申请引用文献中引用或参考的所有文献、以及在本文中引用或参考的所有文献(“本文引用的文献”)、在本文中引用的文献中引用或参考的所有文献，连同针对在本文中提及或通过引用结合在本文中的任何文献中的任何产品的任何制造商的说明书、说明、产品规格、和产品表，特此通过引用并入本文，并且可以在本专利技术的实践中采用。更具体地说，所有参考的文献均通过引用并入本文，其程度如同每个单独的文献被确切地并单独地指明通过引用而并入本文。专利
本专利技术总体上涉及用于控制涉及序列靶向的基因表达的系统、方法、和组合物的递送、工程化、优化和治疗应用，该序列靶向例如涉及规律间隔成簇短回文重复序列(CRISPR)及其组分的基因组干扰或基因编辑。具体而言，本专利技术涉及与递送至有丝分裂后细胞相关的方面，包括但不限于脑或肾，以用于在所述细胞中病症的基因疗法，涉及理解在所述细胞中的基因功能和创建包含所述细胞的模型。关于联邦资助研究的声明本专利技术是在美国国立卫生研究院颁发的NIH先锋奖(PioneerAward)(1DP1MH100706)的政府支持下完成的。美国政府享有本专利技术的某些权利。专利技术背景在基因组测序技术和分析方法中的最新进展显著加速了对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。精确的基因组靶向技术对于通过允许个体遗传元件的选择性干扰而使得因果性遗传变异的统性逆向工程成为可能、以及推进合成生物学、生物技术应用、和医学应用是需要的。虽然基因组编辑技术，如设计师锌指、转录激活子样效应因子(TALE)、或归巢大范围核酸酶(homingmeganuclease)对于产生靶向的基因组干扰是可得的，但是仍然需要负担得起的、易于建立的、可扩展的、并且便于靶向真核基因组内的多个位置的新的基因组工程技术。专利技术概述该CRISPR-Cas系统不要求产生针对靶特异性序列的定制蛋白，相反，通过识别特异性DNA靶的短RNA分子可以对单个Cas酶进行程序设计。将该CRISPR-Cas系统添加到基因组测序技术和分析方法的组库中可以显著使该方法论简化并且提高对与范围广泛的生物功能和疾病相关联的遗传因子进行编目和映射的能力。为了有效而无有害作用地利用CRISPR-Cas系统用于基因组编辑，了解这些基因组工程工具的工程化、优化和细胞类型/组织/器官特异性递送等方面是至关重要的，这些方面是所要求的本专利技术方面。对于用于一系列广泛的应用的核酸序列靶向的替代性的稳健的系统和技术存在着迫切需要。本专利技术的多个方面着手解决这种需要并且提供了相关优点。示例性CRISPR复合物包括与指导序列复合的CRISPR酶，该指导序列与靶多核苷酸内的靶序列杂交。该指导序列与tracr配对序列连接，该tracr配对序列进而与tracr序列杂交。在一方面，本专利技术提供了使用CRISPR-Cas系统的一个或多个元件的方法。本专利技术的CRISPR复合物提供了用于修饰靶多核苷酸的有效手段。本专利技术的CRISPR复合物具有多种多样的实用性，包括修饰(例如，缺失、插入、转位、失活、激活)各种组织和器官中的多种细胞类型中的靶多核苷酸。正因为如此，本专利技术的CRISPR复合物在例如基因或基因组编辑、基因治疗、药物发现、药物筛选、疾病诊断、以及预后中具有广阔的应用谱。设想了在体内、体外和离体用途。本专利技术的方面涉及在具备具有优化活性的指导RNA的CRISPR-Cas9系统中的、具有改进的有丝分裂后细胞靶向特异性的、在长度上小于野生型Cas9酶的Cas9酶和编码它的核酸分子，和嵌合的Cas9酶，以及改进Cas9酶的靶特异性或设计CRISPR-Cas9系统的方法，所述方法包括设计或制备具有优化活性的指导RNA和/或选择或制备具有比野生型Cas9更小的尺寸或长度的Cas9酶，由此将编码它的核酸包装到递送载体是更高级的(因为在该递送载体中对它的编码少于野生型Cas9)中，和/或产生嵌合Cas9酶。还提供了本专利技术的序列、载体、酶或系统在医学中的用途。还提供了它们在基因或基因组编辑中的用途。这有关有丝分裂后细胞组织或细胞，不论是在体内还是离体，在本专利技术的另外方面，Cas9酶可以包含一个或多个突变，并且可以用作具有或不具有与功能结构域融合的通用DNA结合蛋白。这些突变可以是人工引入的突变或获得性和丢失性功能突变。这些突变可以包括但不限于分别在RuvC和HNH催化结构域中的催化结构域(D10和H840)之一中的突变。已经表征了其他的突变。在本专利技术的一个方面，该转录激活结构域可以是VP64。在本专利技术的其他方面，该转录阻遏物结构域可以是KRAB或SID4X。本发明的其他方面涉及融合到结构域上的突变的Cas9酶，这些结构域包括但不限于，转录激活剂、阻遏物、重组酶、转座酶、组蛋白重塑剂(histoneremodeler)、脱甲基酶、DNA甲基转移酶、隐花色素、光可诱导/可控制结构域或化学可诱导/可控制结构域。在一个另外的实施例中，本专利技术提供了产生突变体tracrRNA和允许增强这些RNA在细胞中的性能的同向重复序列或突变体嵌合指导序列的方法。本专利技术的方面还提供了所述序列的选择。本专利技术的方面还提供了简化CRISPR复合物的组分的克隆和递送的方法。在本专利技术的优选实施例中，适合的启动子，如U6启动子，与DNA寡核苷酸一起扩增并且添加到指导RNA上。然后将生成的PCR产物转染到细胞中以驱动指导RNA的表达。本专利技术的方面还涉及体外转录的或从合成公司订购并且直接转染的指导RNA。在一个方面，本专利技术提供了通过使用更具活性的聚合酶来提高活性的方法。在一个优选的实施例中，这些指导RNA在T7启动子控制下的表达是由该细胞中的T7聚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过操纵感兴趣的基因组座位中的有丝分裂后细胞靶序列来修饰生物或非人类生物从而引起该细胞中的表型改变的方法，该方法包括递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：(A)‑I.CRISPR‑Cas系统RNA多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的有丝分裂后细胞靶序列上，(b)tracr配对序列，和(c)tracr序列，以及II.编码CRISPR酶的多核苷酸序列，该CRISPR酶任选地包含至少一个或多个核定位序列，其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR复合物与该有丝分裂后细胞靶序列的序列特异性结合，并且其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该有丝分裂后细胞靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且编码CRISPR酶的多核苷酸序列是DNA或RNA，其中编码该CRISPR酶的多核苷酸序列可操作地连接至该CRISPR酶的表达的一个或多个调节序列，借此在该CRISPR酶的表达的情况下在该有丝分裂后细胞中存在该CRISPR复合物的组装，以及其操纵。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.06.17 US 61/836,123;2013.07.17 US 61/847,537;1.一种通过操纵感兴趣的基因组座位中的有丝分裂后细胞靶序列来修饰生物或非人
类生物从而引起该细胞中的表型改变的方法，该方法包括
递送非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含：
(A)-I.CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列，其中该多核苷酸序列包含：
(a)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的有丝分裂后细胞靶序列上，
(b)tracr配对序列，和
(c)tracr序列，以及
II.编码CRISPR酶的多核苷酸序列，该CRISPR酶任选地包含至少一个或多个核定位序
列，
其中(a)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR
复合物与该有丝分裂后细胞靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该有丝分裂后细胞靶序列上的该指导序列、和
(2)杂交到该tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，并且编码CRISPR酶的多核
苷酸序列是DNA或RNA，
其中编码该CRISPR酶的多核苷酸序列可操作地连接至该CRISPR酶的表达的一个或多
个调节序列，借此在该CRISPR酶的表达的情况下在该有丝分裂后细胞中存在该CRISPR复合
物的组装，以及其操纵。
2.如权利要求1所述的方法，其中编码CRISPR酶的多核苷酸序列、指导序列、tracr配对
序列或tracr序列的任一者或全部可以是RNA。
3.如权利要求1或2所述的方法，其中对该编码CRISPR酶的序列、该指导序列、tracr配
对序列或tracr序列进行编码的多核苷酸可以是RNA并且可以经由脂质体、纳米粒子、外泌
体、微囊泡、或基因枪进行递送。
4.如权利要求1到3中任一项所述的方法，其中这些多核苷酸被包含在含有一种或多种
载体的载体系统中。
5.一种通过操纵感兴趣的基因组座位中的有丝分裂后细胞靶序列来修饰生物或非人
类生物的方法，该方法包括
递送包含病毒载体系统的非天然存在的或工程化的组合物，该病毒载体系统包含一种
或多种病毒载体，该一种或多种病毒载体可操作地编码用于其表达的组合物，其中该非天
然存在的或工程化的组合物包括：
非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或多
种载体，该一种或多种载体包含
I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列
上，其中该多核苷酸序列包含
(A)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的肾脏靶序列上，
(b)tracr配对序列，和
(c)tracr序列，以及
II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，该
CRISPR酶任选地包含至少一个或多个核定位序列，
其中(A)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR
复合物与该肾脏靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该肾脏靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该
tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶。
6.如权利要求5所述的方法，其中这些病毒载体的一种或多种可以经由脂质体、纳米粒
子、外泌体、微囊泡、或基因枪进行递送。
7.一种在对其有需要的受试者或非人类受试者中治疗或抑制由感兴趣基因组座位内
的肾脏靶序列的缺陷引起的病症的方法，该方法包括通过操纵该肾脏靶序列来修饰该受试
者或非人类受试者，并且其中该病症对于通过操纵该肾脏靶序列的治疗或抑制是敏感的，
该方法包括提供包括以下项的治疗：
递送包含AAV或慢病毒载体系统的非天然存在的或工程化的组合物，该载体系统包含
一种或多种AAV或慢病毒载体，该一种或多种AAV或慢病毒载体可操作地编码用于其表达的
组合物，其中在表达时该肾脏靶序列由该非天然存在的或工程化的组合物操纵，其中该非
天然存在的或工程化的组合物包括：
(A)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或
多种载体，该一种或多种载体包含
I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接到CRISPR-Cas系统RNA多核苷酸序列
上，其中该多核苷酸序列包含
(A)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的肾脏靶序列上，
(b)tracr配对序列，和
(c)tracr序列，以及
II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接到编码CRISPR酶的酶编码序列上，该
CRISPR酶包含至少一个或多个核定位序列，
其中(A)、(b)和(c)以5’到3’方向排列，
其中组分I和II位于该系统的相同或不同载体上，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR
复合物与该肾脏靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该肾脏靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该
tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶，
或者
(B)非天然存在的或工程化的组合物，该组合物包含载体系统，该载体系统包含一种或
多种载体，该一种或多种载体包含
I.第一调节元件，该第一调节元件可操作地连接至
(A)指导序列，该指导序列能够杂交到真核细胞中的肾脏靶序列上，以及
(b)至少一种或多种tracr配对序列，
II.第二调节元件，该第二调节元件可操作地连接至编码CRISPR酶的酶编码序列，以及
III.第三调节元件，该第三调节元件可操作地连接至tracr序列，
其中组分I、II和III位于该系统的相同或不同载体上，
其中在转录时，该tracr配对序列杂交到该tracr序列上，并且该指导序列引导CRISPR
复合物与该肾脏靶序列的序列特异性结合，并且
其中该CRISPR复合物包含与(1)杂交到该肾脏靶序列上的该指导序列、和(2)杂交到该
tracr序列上的该tracr配对序列复合的CRISPR酶。
8.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该方法是在体外、和/或离体地进行的。
9.如以上权利要求中任一项所述的方法，包括诱导表达。
10.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该生物或受试者是真核生物。
11.如权利要求10所述的方法，其中该生物或受试者是非人类真核生物。
12.如权利要求1到11中任一项所述的方法，其中该生物或受试者是哺乳动物或非人类
哺乳动物。
13.如权利要求4到8中任一项所述的方法，其中该病毒载体是AAV或慢病毒载体。
14.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该CRISPR酶是Cas9。
15.根据以上权利要求中任一项所述的方法，其中该指导序列的表达是在T7启动子控
制下并且是由T7聚合酶的表达驱动的。
16.一种递送如以上权利要求中任一项所述的CRISPR酶的方法，该方法包括向细胞递
送编码该CRISPR酶的mRNA。
17.如权利要求1到16中任一项所述的方法，其中通过将编码该CRISPR酶的mRNA递送到
该细胞而将编码该CRISPR酶的该多核苷酸或酶编码序列递送至该细胞。
18.一种制备如权利要求7所述的AAV或慢病毒载体的方法，该方法包括将含有编码该
AAV或慢病毒的一种或多种核酸分子或基本上由该一种或多种核酸分子组成的一种或多种
质粒转染到AAV感染的或慢病毒感染的细胞中，并且提供对于该AAV或慢病毒的复制和包装
必须的AAVAAV或慢病毒rep和/或cap和/或辅助核酸分子。
19.一种制备用于在权利要求7所述的方法中使用的AAV或慢病毒载体的方法，该方法
包括将含有编码该AAV或慢病毒的一种或多种核酸分子或基本上由该一种或多种核酸分子
组成的一种或多种质粒转染到AAV感染的或慢病毒感染的细胞中，并且提供对于该AAV或慢
病毒的复制和包装必须的AAVAAV或慢病毒rep和/或cap和/或辅助核酸分子。
20.如权利要求18或19所述的方法，其中对于该AAV或慢病毒的复制和包装必须的AAV
或慢病毒rep和/或cap是通过用一种或多种辅助质...

【专利技术属性】
技术研发人员：张锋，M·海登里希，L·斯维奇，
申请(专利权)人：布罗德研究所有限公司，麻省理工学院，
类型：发明
国别省市：美国;US