本发明专利技术公开一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法及试剂盒。本发明专利技术首先提供了利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的试剂盒，包含：多个不同GC含量的标准品，文库稀释液，qPCR预混液，核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物，ddH2O。本发明专利技术还提供了利用上述试剂盒进行qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法。本发明专利技术试剂盒和方法定量精确、使用方便、适用范围广、选择性强、灵敏度高、特异性好、稳定性好，为高质量高效率的测序提供了保证。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及高通量测序领域，即二代测序(NGS)范畴。更具体地，涉及一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法和试剂盒。
技术介绍
随着科技的不断进步，传统的Sanger测序已经不能完全满足研究和应用的需求，对基因组测序，需求费用更低、速度更快、通量更高的测序技术——第二代测序技术(NGS)应运而生。测序文库的定量分析和质量评价对于获得高质量的核酸测序数据十分重要，要控制NGS测序仪上测序文库的载入量，保证测序数据的质量，就需要在测序前对DNA测序文库进行精确的定量检测分析，力求准确地预测簇密度，从而合理安排样本的上样量和上样比例。文库精确的定量对于二代测序的结果非常关键，过低估计文库的大小，容易导致clusters或多重模板太多，数据质量不高；过高估计文库的大小，导致数据读取量少，基因组覆盖率低，所以低估或高估文库的量都会影响测序质量与效果。NGS流程使用多种文库定量方法，例如qPCR定量法、分光光度计(如NanoDrop)、荧光染料法(Qubit)或电泳设备(Bioanalyzer)，其中，qPCR定量法只测定可扩增文库的分子(双端接头完整)，避免非特异性检测，测定值与真实值最接近，并且检测灵敏度最高，非常适合低浓度文库(PCR-free文库)的检测，因此，qPCR是DNA文库定量的金标准，也是唯一一种能够准确检测出分子数目的方法。理论上来说，文库定量试剂盒所定量的浓度应该与分光光度计方法定量的浓度接近或比其低。qPCR法进行准确定量的一个前提是保证标准品和未知样品的扩增效率相同，否则无法进行精确定量。针对不同GC含量的文库定量，特别是高GC/AT的文库，为保证qPCR法的准确定量，目前主要通过改善DNA聚合酶避免PCR扩增的偏好性、优化反应体系(添加GCbuffer)、优化反应条件(提高预变性温度)等方式进行，例如市场上主流产品KAPALibraryQuantificationKits中包含有的KAPASYBRFASTDNA聚合酶，宣称针对高GC/AT的DNA片段可以获得相似的扩增效率，但是我们的多次比较实验，检测相同浓度的不同GC含量的标准品，结果发现其Ct值会有明显差异(图1)，这说明其依然无法保证完全相同的扩增效率，避免模板的扩增偏好性，对于富含GC/AT的标准品扩增效率要低。因此，如果只用一种GC含量的标准品，目前的方法无法对不同GC含量的文库进行精确定量，然而通过改变标准品的GC含量的研究几乎没有相关的报道。本专利技术人研究发现不同GC含量的文库模板DNA模板的GC含量是影响qPCR扩增的一个重要因素，特别是富含GC/AT模板的扩增，当以相同引物、同一条件扩增不同GC含量的目的片段，其Ct值会有明显差异。另外，本专利技术人还发现不同形式的模板(质粒、gDNA、cDNA、PCR产物、人工合成片段等)扩增效率也会不一样，研究报道线性片段的DNA模板比质粒模板的Ct值明显要小，特别是对于低拷贝数的模板，线性片段DNA更容易被扩增。生物界(动物、植物、细菌、真菌、病毒等)不同物种基因组DNA的GC含量差异很大(20％-80％)，因此，开发出一种针对不同GC含量的文库模板，选择与文库GC含量接近的线性片段DNA标准品的利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的试剂盒和方法，对于第二代测序结果精确性具有重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一种利用qPCR精确定量Illumina平台不同GC含量的二代测序文库的试剂盒，使得qPCR文库定量的准确性更高，进而获得高质量的测序结果；本专利技术的目的之二是提供一种利用上述试剂盒进行qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的方法。为达到上述目的，本专利技术采用下述技术方案：一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的试剂盒，包括：多个不同GC含量的标准品，文库稀释液，qPCR预混液，引物(PrimerPremix)，ddH2O；其中，所述引物为PrimerP5:5’-AATGATACGGCGACCACCGA-3’(SEQIDNO:1所示)PrimerP7:5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGA-3’(SEQIDNO:2所示)。进一步，所述不同GC含量的标准品是通过使用电脑随机合成的不同GC含量的DNA片段，所述不同GC含量的标准品个数可以为2-10个，优选的为3-9个，更优选的为5-7个；所述标准品的GC含量为20％-80％，其中，至少有一个标准品的GC含量为20％-50％，有一个标准品的GC含量为50％-80％；所述标准品是线性DNA片段，其中，包含有P5/P7接头引物序列。不同物种基因组GC含量差异明显，二代测序构建的DNA文库GC含量不同。如果不考虑文库的GC含量差异，只选择单一的标准品，利用qPCR定量时由于DNA聚合酶扩增效率不一样，缺乏针对不同GC含量的标准品，导致文库定量不准确，富含GC/AT序列文库以及低样品文库定量差异更加明显，无法准确地预测簇密度，严重影响测序质量与效果。本专利技术创新性地设计涵盖GC含量范围的多个特征性标准品(2-10个，3-9个，4-8个或者5-7个，但不限于此)，都是包含有P5/P7接头引物序列的线性DNA片段，方便根据文库的GC含量选择最佳标准品，确保qPCR文库定量的准确性，合理安排不同GC含量样本的上样量和上样比例，获得高质量的测序结果。表1与表2分别列出了可以设计的5个或者7个标准品的GC含量。表15个DNA标准品的GC含量表27个DNA标准品的GC含量进一步，所述标准品为预先稀释好的标准品。试剂盒中的标准品一般选用预先梯度稀释好的，方便直接使用，确保稳定性，避免操作误差。进一步，所述标准品的扩增片段的大小为300-600bp，优选的为400-500bp，更优选的为420bp。本专利技术DNA标准品是专为二代测序平台设计，根据二代测序文库一般为平均长度为300-600bp的线性片段这个特性，因此，通过使用电脑随机合成了不同GC含量的DNA片段，其扩增大小应在300-600bp范围内，优选的为400-500bp，更优选的为420bp。进一步，所述文库稀释液除了缓冲体系，还包括有一种或者多种稳定剂；所述缓冲体系为该领域内常用的缓冲体系，优选的为Tris-HCl，更优选的为pH＝8.0的10mMTris-HCl；所述稳定剂为BSA、carrierRNA、tRNA、carrierDNA、EDTA、Tween20中的一种或多种；优选的，所述BSA的浓度为0.2-2mg/ml、carrierRNA的浓度为0.01-0.2mg/ml、tRNA的浓度为0.01-0.2mg/ml、carrierDNA的浓度为0.01-0.1mg/ml、EDTA的浓度为0.2-2mM、Tween20的浓度为0.02％-0.1％。制作标准曲线时梯度稀释标准品的稀释液如果直接用水或TEBuffer稀释，由于受微管吸附作用等的影响，往往不能准确地进行稀释，容易导致实验结果精度降低。使用本专利技术中的文库稀释液来稀释文库与标准品，即使稀释至低浓度也能够进行准确地稀释，容易在宽广范围内获得准确定量的标准曲线，并且不影响PCR反应，用其稀释后的样品可直接使用，并且可以稳定保存DNA样品。进一步，所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的试剂盒，其特征在于，包括：多个不同GC含量的标准品，文库稀释液，qPCR预混液，引物，ddH2O；其中，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
1.一种利用qPCR精确定量不同GC含量的二代测序文库的试剂盒，其特征在于，包括：多个不同GC含量的标准品，文库稀释液，qPCR预混液，引物，ddH2O；其中，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述不同GC含量的标准品个数可以为2-10个，优选的为3-9个，更优选的为5-7个；所述标准品的GC含量为20％-80％，其中，至少有一个标准品的GC含量为20％-50％，有一个标准品的GC含量为50％-80％；优选的，所述标准品是预先稀释好的标准品。3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品是线性DNA片段，其中，包含有P5/P7接头引物序列。4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述标准品的扩增片段的大小为300-600bp，优选的为400-500bp，更优选的为420bp。5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述文库稀释液除了缓冲体系，还包括有一种或多种稳定剂；优选的，所述稳定剂为BSA、carrierRNA、tRNA、carrierDNA、EDTA、Tween20中的一种或多种。6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述BSA的浓度为0.2-2mg/ml、carrierRNA的浓度为0.01-0.2mg/ml、tRNA的浓度为0.01-0.2mg/ml、carrierDNA的浓度为0.01-0.1mg/ml、EDTA的浓度为0.2-2m...
【专利技术属性】
技术研发人员：姜交华，耿亮，辛文，
申请(专利权)人：北京全式金生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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