本发明专利技术涉及分子遗传学领域，具体涉及本发明专利技术提供一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记H14及其应用方法，应用分子标记H14辅助选育抗褐飞虱水稻的方法是以水稻基因组DNA为模板，H14为引物进行PCR扩增，通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果有260bp的单条带，则表示该检测样品为Bph14基因纯合；如果有390bp的单条带，则表示该检测样品不含Bph14基因；如果有260bp和390bp两条带，则表示该检测样品为Bph14基因杂合。该标记通过序列差异设计不存在遗传交换，准确性高；直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高效率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及分子遗传学领域，具体的说是一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用。
技术介绍
褐飞虱属同翅目飞虱科，以水稻为主要的寄主。褐飞虱通过口针吸食水稻维管束鞘汁液，严重时造成稻株基部变黑、倒伏甚至枯死。褐飞虱在取食时传播水稻草状丛矮病和齿叶矮缩病，同时也促使水稻纹枯病、小球菌核病的传播。随着耕作方式的改变和高产品种的大面积推广，褐飞虱危害逐年加重，已经成为我国和东南亚水稻生产的首要虫害，对粮食生产安全造成严重威胁。选育和种植抗褐飞虱水稻品种是最经济、最有效、对环境最友好的防控方法。20世纪70年代以来，国内外学者在栽培稻和野生稻品种中相继鉴定出大量抗性材料，也开展了大量的抗虫基因定位和发掘工作。迄今为止，已报道定位了30个抗褐飞虱主效基因，其中Bph14基因是第一个通过图位克隆方法得到的抗褐飞虱基因。携带Bph14的水稻品系B5或者重组自交系RI35抗褐飞虱，而没有携带Bph14的水稻品种台中1号则对褐飞虱敏感，褐飞虱接虫后表现为茎秆枯黄，叶片萎蔫，育性降低甚至整株死亡。Bph14cDNA全长9576bp，包含有3个外显子，编码一个由1323氨基酸组成的蛋白产物。产物包含卷曲螺旋结构域、核苷酸结合结构域和富亮氨酸重复序列（CC-NB-LRR）。重组自交系RI35与台中1号中的Bph14基因序列差异很大，其中CC域和NB域很保守，而LRR具有独特的差异。采用传统的回交选育抗虫水稻品种，需要在后代进行抗虫鉴定，费时费力，育种周期较长，利用分子标记辅助育种可以加快抗虫基因选育进程。目前选择Bph14基因改良水稻褐飞虱抗性的研究中主要利用其连锁标记（MRG2329，76-2等），但存在分辨率和准确性较低的缺点。基于以上原因，需要新的一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用被设计出来，通过Bph14基因在抗感品种中的DNA序列差异设计开发基因标记，并利用基因标记对水稻褐飞虱抗性进行定向改良，提高育种效率，即一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用。
技术实现思路
为了解决上述现有水稻褐飞虱抗性改良的技术问题，本专利技术提供一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案是：一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用，提供应用分子标记H14辅助选育抗褐飞虱水稻的方法是以水稻基因组DNA为模板，H14为引物进行PCR扩增，通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果有260bp的单条带，则表示该检测样品为Bph14基因纯合；如果有390bp的单条带，则表示该检测样品不含Bph14基因；如果有260bp和390bp两条带，则表示该检测样品为Bph14基因杂合。进一步地，所述的一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记H14，其正反引物序列为：H14F：5’-GCAGAGCTAACTAACGCAG-3’H14R：5’-TGGTCCTGAAACTGCTACT-3’进一步地，所述水稻基因组DNA提取方法为常规CTAB法。进一步地，所述PCR扩增体系为：20ng水稻基因组DNA模板，10μlTaqPCRMastermix，10uM的前后引物各1uL，补充ddH2O至20μL。进一步地，所述PCR程序为：95℃预变性5min，然后按95℃30s，55℃下30s，72℃下1min进行30个循环，最后72℃下延伸5min。本专利技术的有益效果是：本专利技术利用核苷酸序列差异设计Bph14基因的功能分子标记，不存在遗传交换，准确性高；由于扩增片段差异较大可直接用于琼脂糖凝胶电泳检测，更为简便；为共显性标记，可以检测纯合和杂合个体，缩短育种周期，提高效率。附图说明下面结合附图和实施例对本专利技术进一步说明。图1是本专利技术中Bph14基因在B5和日本晴基因组上的部分序列比对结果及H14标记的位置信息；图2是本专利技术H14标记对8个水稻品种的电泳检测图。其中：图1中虚线表示缺失碱基，从第7454到7593个碱基之间，B5和日本晴相比缺失了135碱基；图2中1-8分别表示水稻品种沪旱1B，秀水123，沪旱7B，黄华占，中组14，沪旱15，日本晴和B5。M表示D2000Marker。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。如图1-图2所示，本专利技术所述的一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用，提供应用分子标记H14辅助选育抗褐飞虱水稻的方法是以水稻基因组DNA为模板，H14为引物进行PCR扩增，通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果有260bp的单条带，则表示该检测样品为Bph14基因纯合；如果有390bp的单条带，则表示该检测样品不含Bph14基因；如果有260bp和390bp两条带，则表示该检测样品为Bph14基因杂合。进一步地，所述的一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记H14，其正反引物序列为：H14F：5’-GCAGAGCTAACTAACGCAG-3’H14R：5’-TGGTCCTGAAACTGCTACT-3’进一步地，所述水稻基因组DNA提取方法为常规CTAB法。进一步地，所述PCR扩增体系为：20ng水稻基因组DNA模板，10μlTaqPCRMastermix，10uM的前后引物各1uL，补充ddH2O至20μL。进一步地，所述PCR程序为：95℃预变性5min，然后按95℃30s，55℃下30s，72℃下1min进行30个循环，最后72℃下延伸5min。作为本专利技术一个较佳的实施例，本专利技术实施例中数据如下：1、供试材料：抗虫水稻品种：B5感虫水稻品种：沪旱1B，秀水123，沪旱7B，黄华占，中组14，沪旱15，日本晴2、水稻基因组DNA提取方法参考楼巧君（2006）中所述方法。（楼巧君,陈亮,罗利军.三种水稻基因组DNA快速提取方法的比较[J].分子植物育种,2006,3(5):749-752）3、基因分子标记H14的开发：Bph14基因与参考基因组日本晴的同源基因有83%的相似性，在第7454到7593个碱基之间，B5和日本晴相比缺失了135碱基。根据核苷酸序列差异，利用PrimerPremier5.0软件设计引物H14，其正反引物序列为：H14F：5’-GCAGAGCTAACTAACGCAG-3’H14R：5’-TGGTCCTGAAACTGCTACT-3’4、基因型检测：利用功能标记H14对供试水稻品种进行PCR扩增，PCR扩增体系为：20ng水稻基因组DNA模板，10μlTaqPCRMastermix，10uM的前后引物各1uL，补充ddH2O至20μL。PCR反应程序为：95℃预变性5min，然后按95℃30s，55℃下30s，72℃下1min进行30个循环，最后72℃下延伸5min。取PCR产物8uL上样于2%的琼脂糖凝胶电泳检测，抗虫水稻品种B5扩增出260bp的单条带，在其他感虫水稻品种中均扩增出390bp的单条带，电泳条带清晰，差异明显，表明可以利用该标记进行水稻抗褐飞虱基因Bph14的辅助育种。以上显示和描述了本专利技术的基本原理、主要特征和本专利技术的优点。本行业的技术人员应该了解，本专利技术不受上述实施例的限制，上述实本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用，其特征在于：提供应用分子标记H14辅助选育抗褐飞虱水稻的方法是以水稻基因组DNA为模板，H14为引物进行PCR扩增，通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果有260bp的单条带，则表示该检测样品为Bph14基因纯合；如果有390bp的单条带，则表示该检测样品不含Bph14基因；如果有260bp和390bp两条带，则表示该检测样品为Bph14基因杂合。
【技术特征摘要】
1.一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用，其特征在于：提供应用分子标记H14辅助选育抗褐飞虱水稻的方法是以水稻基因组DNA为模板，H14为引物进行PCR扩增，通过2%的琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物，如果有260bp的单条带，则表示该检测样品为Bph14基因纯合；如果有390bp的单条带，则表示该检测样品不含Bph14基因；如果有260bp和390bp两条带，则表示该检测样品为Bph14基因杂合。2.根据权利要求1所述的一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记及应用，其特征在于：所述的一个水稻抗褐飞虱基因Bph14的分子标记H14，其正反引物序列为：H14F：5’-GCAGAGCTAACTAACGCAG-3’H14R...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘毅，刘国兰，王飞名，张安宁，唐金娟，毕俊国，余新桥，
申请(专利权)人：上海市农业生物基因中心，
类型：发明
国别省市：上海;31
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