一种米卡芬净前体的制备方法技术

本发明专利技术提供了一种米卡芬净前体的制备方法，该制备方法通过少量的米卡芬净前体产生菌孢子悬液并培养，并在发酵进行过程中向发酵液中加入氧载体，提高发酵罐内的溶解氧浓度，提高了米卡芬净前体的产量20％～40％；发酵液经酸化破壁处理，并使用大孔树脂吸附极性溶剂解析得到米卡芬净前体解析液，再由解析液通过结晶得到米卡芬净前体物粉末；本发明专利技术能够得用于合成米卡芬净前体，并且操作程序简单，方法稳定，重现性好，非常适合产业化生产；同时，避免使用酮等有毒溶剂，减低了对环境及人体的危害性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物制药
，尤其涉及一种米卡芬净前体的制备方法。
技术介绍
近年来，随着广谱抗菌药物和免疫抑制剂的大量应用、肿瘤化疗、器官移植以及艾滋病的蔓延等，导致免疫系统受到抑制的人群不断增多，深部真菌感染的发病率开始呈现明显的上升趋势，且随着抗真菌药物的运用，真菌的耐药性也越来越强，使得抗真菌药物的应用有迅猛增加的趋势。因此，抗深部真菌感染的药物已成为抗感染药的研究热点之一，日益引起人们的关注。棘白菌素是一类新型的抗真菌药，与目前临床常用抗真菌药物的作用机制明显不同，是β-1，3-葡聚糖合成酶的抑制剂，作用于真菌的细胞壁。细胞壁是真菌与哺乳动物细胞之间最大的差别，所以干扰细胞壁的合成，影响细胞壁的完整性将导致真菌细胞死亡而对人无伤害，因此副作用较小，安全性较高。米卡芬净是一种水溶性半合成棘白菌素类抗真菌药物，由前体化合物FR901379(或称“WF11899A”)经脱酰基化酶水解后合成得到。米卡芬净前体化合物FR901379是鞘茎点霉属(Coleophomasp.)的发酵代谢产物，是合成米卡芬净的主要原料，其结构式如下：中国专利技术专利，公告号CN102952179B，公开了《一种高纯度米卡芬净前体化合物FR901379的制备方法》，其公开的技术方案实质上为对米卡芬净前体的纯化路线，其并没揭示如何合成米卡芬净前体，且存在操作繁琐，制备路线较长的问题。同时，中国专利技术专利，公开号CN103848900A，其公开了《一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法》，其本质上也属于对米卡芬净前体的纯化路线，并需要使用C1～C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液，并需要通过反向色谱柱进行洗脱收集并借以HPLC跟踪检测。因此，也存在制备米卡芬净前体的操作步骤繁琐，制备工艺复杂，且需要使用酮这些对人体及环境有害的化学试剂，因此不太适合产业化大规模生产。有鉴于此，有必要对现有技术中的米卡芬净前体的制备方法予以改进，以解决上述问题。
技术实现思路
本专利技术的目的在于公开一种米卡芬净前体的制备方法，用以实现米卡芬净前体的产业化应用，降低制备难度，减少制备过程对人体及环境造成不良影响。为实现上述专利技术目的，本专利技术提供了一种米卡芬净前体的制备方法，包括以下步骤：步骤(1)、取少量米卡芬净前体产生菌孢子悬液，接种于种子培养基上，于24～28℃下，培养2～4天；步骤(2)、将种子培养基接种于发酵罐中并添加发酵培养基进行发酵，发酵罐中的发酵温度为24～28℃，发酵时间为10～12天；步骤(3)、当发酵至40～60h时补加氧载体，并在发酵过程中当总糖低于2.0g/100mL时流加补料培养基；步骤(4)、向发酵液中添加酸使发酵液的pH呈3～4，板框过滤，然后添加极性溶剂进行抽提浓缩，制得米卡芬净前体浓缩液；步骤(5)、将米卡芬净前体浓缩液经大孔树脂吸附，极性溶剂解析，制得米卡芬净前体解析液；步骤(6)、米卡芬净前体解析液经结晶，干燥，制得呈粉末状的米卡芬净前体。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(1)中的种子培养基组成为：葡萄糖5～15g/L，甘油5～15g/L，玉米浆干粉10～30g/L，酵母粉5～15g/L，胰蛋白胨5～15g/L，氯化钠1～3g/L，磷酸二氢钾1～3g/L和碳酸钙1～3g/L。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(2)中的发酵培养基组成为：葡萄糖5～15g/L，山梨醇70～90g/L，玉米浆干粉6～10g/L，黄豆饼粉20～30g/L，柠檬酸三铵2～4g/L，七水硫酸亚铁0.2～0.4g/L，硫酸铵2～4g/L，七水硫酸镁1～3g/L，碳酸钙3～5g/L和磷酸氢二钾1～3g/L。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(3)中的氧载体选自正己烷、正十二烷或吐温-80；氧载体的补加量为发酵罐体积的1.0％～3.0％。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(3)中的补料培养基组成为：葡萄糖0.5～1.0g/L，玉米浆干粉0.05～0.2g/L，黄豆饼粉0.05～0.2g/L和碳酸钙0.01～0.05g/L。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(4)及步骤(5)中的极性溶剂选自甲醇、乙醇或者乙腈。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(5)中的大孔树脂选自HP20大孔树脂、D1300大孔树脂或者SP207大孔树脂。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(6)中的结晶方式为浓缩蒸发结晶或者溶剂沉降结晶，结晶温度为40～60℃；所述溶剂沉降结晶所使用的溶剂选自石油醚、正己烷或者环己烷。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(4)中向发酵液中所添加的酸选自稀硫酸、稀盐酸或者乙酸。作为本专利技术的进一步改进，所述步骤(6)中的干燥方式包括真空干燥、降膜蒸发干燥，干燥温度为40～105℃。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：在本专利技术中，通过少量的米卡芬净前体产生菌孢子悬液并培养，并在发酵进行过程中向发酵液中加入氧载体，提高发酵罐内的溶解氧浓度，提高了米卡芬净前体的产量20％～40％；发酵液经酸化破壁处理，并使用大孔树脂吸附极性溶剂解析得到米卡芬净前体解析液，再由解析液通过结晶得到米卡芬净前体物粉末；本专利技术能够得用于合成米卡芬净前体，并且操作程序简单，方法稳定，重现性好。具体实施方式下面结合各实施方式对本专利技术进行详细说明，但应当说明的是，这些实施方式并非对本专利技术的限制，本领域普通技术人员根据这些实施方式所作的功能、方法、或者结构上的等效变换或替代，均属于本专利技术的保护范围之内。除非说明书中有特殊说明，本专利技术中的各个实施例中的组分、原料均采用分析纯级别。另外，各实施例中的“g”为重量单位“克”；“h”为时间单位“小时”；“ml”为体积单位“毫升”；“室温”为23℃；“BV/H”：空间流速的表示,即是指柱内单位时间(h)流经单位体积树脂平均液量。“HPLC”：高效液相色谱法。实施例一：该米卡芬净前体的制备方法包括以下步骤。步骤(1)、取少量米卡芬净前体，即FR179642(亦即WF11899A)产生菌孢子悬液，接种于种子培养基上进行培养。种子培养基中的各组分为(单位：g/L)：葡萄糖15，甘油15，玉米浆干粉30，酵母粉15，胰蛋白胨15，氯化钠3，磷酸二氢钾3，碳酸钙3，余量为水。24℃培养2天。步骤(2)、将种子培养基接种于发酵罐并添加发酵培养基进行发酵。发酵培养基中的各组分为(单位：g/L)：葡萄糖15，山梨醇90，玉米浆干粉10，黄豆饼粉30，柠檬酸三铵4，七水硫酸亚铁0.4，硫酸铵4，七水硫酸镁3，碳酸钙5，磷酸氢二钾3，余量为水。28℃培养10天。步骤(3)、当发酵进行至40h，补加正己烷作为氧载体。正己烷的补加量为发酵罐体积的1.0％。当总糖量低于2.0g/100mL时，开始进行流加流加补料培养基。该补料培养基中的各组分为(单位：g/L)：葡萄糖0.5，玉米浆干粉0.05，黄豆饼粉0.05，碳酸钙0.01，余量为水。步骤(4)、发酵完成进行放罐后提取，并具体为：提取WF11899A时向发酵液中添加酸，使发酵液酸化至pH呈3，过板框后，加甲醇抽提浓缩，制得米卡芬净前体浓缩液。在本实施例中，向发酵液中添加的酸为浓度为10wt％的稀硫酸。步骤(5)、将米卡芬净前体浓缩液用型号为HP20的大孔树脂吸附。吸附流本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种米卡芬净前体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)、取少量米卡芬净前体产生菌孢子悬液，接种于种子培养基上，于24～28℃下，培养2～4天；步骤(2)、将种子培养基接种于发酵罐中并添加发酵培养基进行发酵，发酵罐中的发酵温度为24～28℃，发酵时间为10～12天；步骤(3)、当发酵至40～60h时补加氧载体，并在发酵过程中当总糖低于2.0g/100mL时流加补料培养基；步骤(4)、向发酵液中添加酸使发酵液的pH呈3～4，板框过滤，然后添加极性溶剂进行抽提浓缩，制得米卡芬净前体浓缩液；步骤(5)、将米卡芬净前体浓缩液经大孔树脂吸附，极性溶剂解析，制得米卡芬净前体解析液；步骤(6)、米卡芬净前体解析液经结晶，干燥，制得呈粉末状的米卡芬净前体。

【技术特征摘要】
1.一种米卡芬净前体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤(1)、取少量米卡芬净前体产生菌孢子悬液，接种于种子培养基上，于24～28℃下，培养2～4天；步骤(2)、将种子培养基接种于发酵罐中并添加发酵培养基进行发酵，发酵罐中的发酵温度为24～28℃，发酵时间为10～12天；步骤(3)、当发酵至40～60h时补加氧载体，并在发酵过程中当总糖低于2.0g/100mL时流加补料培养基；步骤(4)、向发酵液中添加酸使发酵液的pH呈3～4，板框过滤，然后添加极性溶剂进行抽提浓缩，制得米卡芬净前体浓缩液；步骤(5)、将米卡芬净前体浓缩液经大孔树脂吸附，极性溶剂解析，制得米卡芬净前体解析液；步骤(6)、米卡芬净前体解析液经结晶，干燥，制得呈粉末状的米卡芬净前体。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中的种子培养基组成为：葡萄糖5～15g/L，甘油5～15g/L，玉米浆干粉10～30g/L，酵母粉5～15g/L，胰蛋白胨5～15g/L，氯化钠1～3g/L，磷酸二氢钾1～3g/L和碳酸钙1～3g/L。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中的发酵培养基组成为：葡萄糖5～15g/L，山梨醇70～90g/L，玉米浆干粉6～10g/L，黄豆饼粉20～30g/L，柠檬酸三铵2～4g/L，七水硫...

【专利技术属性】
技术研发人员：游云龙，付静，曹峥，杨亮，赵永俊，蔡云洁，金丹甜，
申请(专利权)人：无锡福祈制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32