根培养体系建立的方法涉及一种头花蓼毛状根培养体系建立的方法。本发明专利技术的目的在于提供一种头花蓼毛状根培养体系建立的方法。本发明专利技术的头花蓼毛状根培养体系建立的方法是：1.菌种活化；2.毛状根诱导；3.毛状根离体培养体系的建立；4.毛状根的PCR检测。该头花蓼毛状根培养体系建立的方法，建立了头花蓼毛状根培养体系，为实现黄酮化合物的工业化大规模生产奠定基础，此外，所有过程均在人的控制范围，可消除农药和其它重金属的污染，利于中药产品的质量控制，具有良好的社会效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种头花蓼毛状根培养体系建立的方法。
技术介绍
头花蓼(PolygonumcapitatumBuch-Ham.exD.Don)为蓼科多年生草本植物，是苗族地区的常用草药，主要用于清热解毒、利尿通淋、肾盂肾炎、尿路结石、膀胱炎、痢疾、风湿痛、跌打损伤、尿道感染、疮疡湿疹等症。目前开发出以头花蓼为单方的热淋清胶囊、热淋清颗粒等制剂。并收载于《卫生部药品标准中药成方制剂》中，2000年进入国家基本药物目录。苗药头花蓼是贵州省中药现代化2010年前重点发展的“六大苗药”和“十五”期间重点培育发展的“七大中药产业链”中的品种之一。现阶段，由于头花蓼的栽培资源在遗传背景来上来源于混杂野生群体，人工种植种源缺乏，规模繁殖和试种品种单一。现在头花蓼不仅存在连作障碍，而且一些栽培产区的种质资源已产生了明显的遗传分化，植株发生变异，产量和品质下降，这不仅严重影响了头花蓼栽培的推广及整个产业的良性发展，也制约了头花蓼良种选育的进程。迄今为止，有研究者通过带节茎段、茎尖、无菌萌发苗获取顶芽为外殖体开展组织培养快速繁殖，但缺乏再生体系的研究。因此，开展头花蓼再生体系和毛状根培养的研究，以期为头花蓼种质资源的改良和黄酮化合物的生产提供基础的参考资料。
技术实现思路
本专利技术就是针对上述问题，提供了一种头花蓼毛状根培养体系建立的方法，能开展头花蓼再生体系和毛状根培养的研究。为实现本专利技术的上述目的，本专利技术采用如下技术方案，本专利技术的头花蓼毛状根培养体系建立的方法是。1.菌种活化：将-70□下保存的发根农杆菌(C58C1)菌种按1：1000的比例接种于YEB液体培养基中，同时添加Rif(利福平)至浓度40mg/L，28□、200rpm(转/分钟)活化24h，再按1：1000的比例转至YEB+20mg/LKan(卡那霉素)液体培养基中，添加浓度为100mg/L的AS(乙酰丁香酮)，于28□、120rpm进行二次活化，6～7h后菌液A600达0.3～0.4时接种侵染头花蓼幼苗外植体。2.毛状根诱导：将无菌真叶、幼茎用活化好的菌液侵染外植体5～20min，取出后用滤纸吸干菌液，置于MS+100mg/LAS的培养基上，25±1□黑暗共培养0～3d，用无菌水冲洗干净后接种于附加500mg/LCef(头孢噻腭钠)的MS固体培养基上，进行筛选培养，反复继代除菌至无菌，再转入MS固体培养基上诱导毛状根。3.毛状根离体培养体系的建立：待毛状根长约0.5cm时，选择颜色白且粗壮的毛状根，将其剪下，接种于1/2MS+IBA0.2mg/L液体培养基中，135rpm，25±1□条件下暗培养，每7d继代一次；或不剪下连同外植体一起接种在1/2MS固体培养基上，25±1□暗培养，每4d继代一次。50d后收获单克隆毛状根并测鲜重，每个单克隆取少量用于分子检测，其余液氮速冻后备用。4.毛状根的PCR检测：毛状根和非转化根DNA的提取用常规CTAB法。Ri质粒序列设计rolB和rolC的引物参考文献[9]。PCR条件为94□预变性5分钟；94□变性40s，55□退火40s，72反应1min，35个循环；最后72□延伸8min。PCR扩增产物用0.1％琼脂糖凝胶(Gold-view染色)电泳(120V、100mA、20min)进行检测。电泳结果于凝胶成像系统(UV260nm)下观察拍照。本专利技术的有益效果是：该头花蓼毛状根培养体系建立的方法，建立了头花蓼毛状根培养体系，为实现黄酮化合物的工业化大规模生产奠定基础，此外，所有过程均在人的控制范围，可消除农药和其它重金属的污染，利于中药产品的质量控制，具有良好的社会效益。具体实施方式本专利技术的一种头花蓼毛状根培养体系建立的方法是：1.菌种活化：将-70□下保存的发根农杆菌(C58C1)菌种按1：1000的比例接种于YEB液体培养基中，同时添加Rif(利福平)至浓度40mg/L，28□、200rpm(转/分钟)活化24h，再按1：1000的比例转至YEB+20mg/LKan(卡那霉素)液体培养基中，添加浓度为100mg/L的AS(乙酰丁香酮)，于28□、120rpm进行二次活化，6～7h后菌液A600达0.3～0.4时接种侵染头花蓼幼苗外植体。2.毛状根诱导：将无菌真叶、幼茎用活化好的菌液侵染外植体5～20min，取出后用滤纸吸干菌液，置于MS+100mg/LAS的培养基上，25±1□黑暗共培养0～3d，用无菌水冲洗干净后接种于附加500mg/LCef(头孢噻腭钠)的MS固体培养基上，进行筛选培养，反复继代除菌至无菌，再转入MS固体培养基上诱导毛状根。3.毛状根离体培养体系的建立：待毛状根长约0.5cm时，选择颜色白且粗壮的毛状根，将其剪下，接种于1/2MS+IBA0.2mg/L液体培养基中，135rpm，25±1□条件下暗培养，每7d继代一次；或不剪下连同外植体一起接种在1/2MS固体培养基上，25±1□暗培养，每4d继代一次。50d后收获单克隆毛状根并测鲜重，每个单克隆取少量用于分子检测，其余液氮速冻后备用。4.毛状根的PCR检测：毛状根和非转化根DNA的提取用常规CTAB法。Ri质粒序列设计rolB和rolC的引物参考文献[9]。PCR条件为94□预变性5分钟；94□变性40s，55□退火40s，72反应1min，35个循环；最后72□延伸8min。PCR扩增产物用0.1％琼脂糖凝胶(Gold-view染色)电泳(120V、100mA、20min)进行检测。电泳结果于凝胶成像系统(UV260nm)下观察拍照。该头花蓼毛状根培养体系建立的方法，建立了头花蓼毛状根培养体系，为实现黄酮化合物的工业化大规模生产奠定基础，此外，所有过程均在人的控制范围，可消除农药和其它重金属的污染，利于中药产品的质量控制，具有良好的社会效益。对于本领域技术人员而言，显然本专利技术不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本专利技术的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本专利技术。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本专利技术的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本专利技术内，不应将权利要求中的任何标记视为限制所涉及的权利要求。以上所述，仅为本专利技术较佳的具体实施方式，但本专利技术的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
的技术人员在本专利技术揭露的技术范围内，根据本专利技术的技术方案及其专利技术构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本专利技术的保护范围之内。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种头花蓼毛状根培养体系建立的方法，其特征在于：(1)菌种活化：将‑70□下保存的发根农杆菌(C58C1)菌种按1：1000的比例接种于YEB液体培养基中，同时添加Rif(利福平)至浓度40mg/L，28□、200rpm(转/分钟)活化24h，再按1：1000的比例转至YEB+20mg/L Kan(卡那霉素)液体培养基中，添加浓度为100mg/L的AS(乙酰丁香酮)，于28□、120rpm进行二次活化，6～7h后菌液A600达0.3～0.4时接种侵染头花蓼幼苗外植体。(2)毛状根诱导：将无菌真叶、幼茎用活化好的菌液侵染外植体5～20min，取出后用滤纸吸干菌液，置于MS+100mg/L AS的培养基上，25±1□黑暗共培养0～3d，用无菌水冲洗干净后接种于附加500mg/L Cef(头孢噻腭钠)的MS固体培养基上，进行筛选培养，反复继代除菌至无菌，再转入MS固体培养基上诱导毛状根。(3)毛状根离体培养体系的建立：待毛状根长约0.5cm时，选择颜色白且粗壮的毛状根，将其剪下，接种于1/2MS+IBA0.2mg/L液体培养基中，135rpm，25±1□条件下暗培养，每7d继代一次；或不剪下连同外植体一起接种在1/2MS固体培养基上，25±1□暗培养，每4d继代一次。50d后收获单克隆毛状根并测鲜重，每个单克隆取少量用于分子检测，其余液氮速冻后备用。毛状根的PCR检测：毛状根和非转化根DNA的提取用常规CTAB法。Ri质粒序列设计rolB和rolC的引物参考文献[9]。PCR条件为94□预变性5分钟；94□变性40s，55□退火40s，72反应1min，35个循环；最后72□延伸8min。PCR扩增产物用0.1％琼脂糖凝胶(Gold‑view染色)电泳(120V、100mA、20min)进行检测。电泳结果于凝胶成像系统(UV 260nm)下观察拍照。...
【技术特征摘要】
1.一种头花蓼毛状根培养体系建立的方法，其特征在于：(1)菌种活化：将-70□下保存的发根农杆菌(C58C1)菌种按1：1000的比例接种于YEB液体培养基中，同时添加Rif(利福平)至浓度40mg/L，28□、200rpm(转/分钟)活化24h，再按1：1000的比例转至YEB+20mg/LKan(卡那霉素)液体培养基中，添加浓度为100mg/L的AS(乙酰丁香酮)，于28□、120rpm进行二次活化，6～7h后菌液A600达0.3～0.4时接种侵染头花蓼幼苗外植体。(2)毛状根诱导：将无菌真叶、幼茎用活化好的菌液侵染外植体5～20min，取出后用滤纸吸干菌液，置于MS+100mg/LAS的培养基上，25±1□黑暗共培养0～3d，用无菌水冲洗干净后接种于附加500mg/LCef(头孢噻腭钠)的MS固体培养基上，进行筛选培养，反复继代除菌至无菌，再转入MS固体培养基上诱导毛状...
【专利技术属性】
技术研发人员：张显强，张来，刘天雷，从春蕾，
申请(专利权)人：安顺学院，
类型：发明
国别省市：贵州;52
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