一种用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于蚋类昆虫(黑蝇)分类和鉴定的引物及其制备方法和应用，引物序列SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2；引物片段370bp；引物cytb组合来自于Chris Simon1994。本发明专利技术的引物cytb组合来自于Chris Simon1994，上下游为自己组合，在现有技术中引物未被使用也未被应用于蚋类昆虫(黑蝇)分类中去，未见相关蚋类昆虫(黑蝇)国内外鉴定文章使用过此引物；本发明专利技术的引物片段约370bp，易扩增，在不同种间的表现良好，相较其他引物，对于种下分化的表现要优异一些；比已经应用于蚋类昆虫(黑蝇)的其他cytb引物比要适用范围更广。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物工程
，尤其涉及一种用于蚋类昆虫(黑蝇)分类和鉴定的引物及其制备方法和应用。
技术介绍
蚋虫，属双翅目长角亚目蚋科(Simulidae)，俗称黑蝇(blackfly)、驼背(挖背)和刨锛。古代又称蜹，是医学昆虫中呈世界性分布的一个重要类群。它不但骚扰吸血，侵袭人畜，而且是人类和禽畜类多种疾病的传播媒介，其中包括人盘尾丝虫病(Onchocerciasis)、畜类盘尾丝虫病和由欧氏曼森线虫(MansoneilaOzzanli)引起的曼森丝虫病及禽鸟住白细胞虫病(Leucocytozoonsis)等疾病。由于蚋具群舞习性，成群地在人头部飞行骚扰，可引起人情绪波动，表现为烦躁不安、易激怒等。由于蚋类个体较小且种间形态差异较小，在昆虫分类界是分类学一大挑战，形态分类局限于国内极少数专家，不能全面快速地进行种类鉴别，对是否携带河盲症、盘尾丝虫病原的蚋的分布也不能做出识别，不能有效地做出预警与分析，不能对防治措施的有效制定提供基本信息及数据。现有针对蚋类昆虫(黑蝇)分类和鉴定的引物如COI等在种间表现良好但在种下表现较差，其他引物如ND4，ITS等也存在应用范围有限，使用效果较差，操作比较繁琐等缺点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种用于蚋类昆虫(黑蝇)分类和鉴定的引物及其制备方法和应用，旨在解决现有针对蚋类昆虫(黑蝇)分类和鉴定的引物，应用范围有限，使用效果较差，操作繁琐的问题。本专利技术是这样实现的，一种用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物，所述用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物序列：SEQIDNO：1TATGTACTACCATGAGGACAAATATCSEQIDNO：2AGCAAATAAAAAATATCATTC。进一步，所述用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物片段370bp。本专利技术的另一目的在于提供一种所述用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：步骤一，总DNA的提取，采用试剂盒法，用100μL洗脱液溶解提取的样品，采用核酸滴定仪测定提取DNA的浓度及纯度，进行样品检测或者置于-20℃保存、备用；步骤二，引物筛选，选出备选上游引物13条，下游引物13条，引物序列SEQIDNO：1与SEQIDNO：2的组合；步骤三，以所得基因组DNA为模板，利用上述两对引物对基因组DNA中的线粒体cytb基因进行PCR扩增；步骤四，取适量的PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测结果，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，两对引物扩增的片段大小分别为400bp，将得到的特异性产物测序，利用Chromas2.4软件读取测序结果。进一步，所述PCR反应体系和条件为：PCR反应体系为25μL，含2×PCRMastermix12.5μL，正/反向引物各3μL，DNA模板2μL，含20～50ngDNA，ddH2O补足25μL；PCR反应条件为：94℃下预变性2min；而后35个循环，每个循环包括94℃变性30s，41-51℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。进一步，所述蚋类分子鉴定引物的使用方法，使用1％琼脂糖电泳检测。本专利技术提供的用于蚋类昆虫(黑蝇)分类和鉴定的引物及其制备方法和应用，引物cytb组合来自于ChrisSimon1994，上下游为自己组合，在现有技术中引物未被使用也未被应用于蚋类昆虫(黑蝇)分类中去，未见相关蚋类昆虫(黑蝇)鉴定文章使用过此引物；本专利技术的引物片段约370bp，易扩增，在不同种间的表现良好，相较其他引物，对于种下分化的表现要优异一些；比应用于蚋类昆虫(黑蝇)的其他cytb引物比要适用范围更广。本专利技术运用此引物技术与现有技术相比具有：1、结果准确可靠：已经对采自中国的8种蚋虫进行鉴定验证，结果的可靠性具有充分的保证。2、操作简便：应用本专利技术方法，鉴定蚋类昆虫，一般的普通实验人员即可完成，不需要专业的形态学鉴定知识。3、实用性好：本专利技术所设计出的引物，可用于蚋类幼虫、蛹、成虫的鉴定，只要获得虫体的任何一部分即可鉴定，对样本质量无要求，可以用于害虫的准确预测预报，还可以有关检疫口岸对进出口医学传病蚋类的检测。4、鉴别蚋类昆虫的引物能够扩增蚋的线粒体cytb基因，为蚋科昆虫的鉴别提供简便稳定的分子标记，解决区分蚋科不同种昆虫的难题为今后蚋的生物学、种群动态监测以及综合防治奠定了基础。附图说明图1是本专利技术实施例提供的用于鉴定蚋类昆虫(黑蝇)的引物制备方法流程图。图2为本专利技术所鉴定的蚋的cytb基因扩增结果示意图；其中，第一列为DL2000mark，其余：窄足真蚋(1-3)力行维蚋(4-6)淡额蚋(7-9)后克蚋属(10-12)马维蚋(13-15)新月纺蚋(16-18)庄氏短蚋(19-21)红头厌蚋(22-24)。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。本专利技术实施例的用于鉴定蚋类昆虫(黑蝇)的引物序列SEQIDNO：1。如图1所示，本专利技术实施例的用于鉴定蚋类昆虫(黑蝇)的分子鉴定引物及使用方法包括以下步骤：S101：总DNA的提取，采用试剂盒法，用100μL洗脱液溶解提取的样品，采用核酸滴定仪测定提取DNA的浓度及纯度，进行样品检测或者置于-20℃保存、备用；S102：引物筛选，选出备选上游引物13条，下游引物13条，引物序列SEQIDNO：1与SEQIDNO：2的组合；S103：以所得基因组DNA为模板，利用上述两对引物对基因组DNA中的线粒体cytb基因进行PCR扩增；S104：取适量的PCR扩增产物用琼脂糖电泳检测结果，经溴化乙锭染色后于紫外灯下观察，两对引物扩增的片段大小分别为400bp，将得到的特异性产物测序，利用Chromas2.4软件读取测序结果。在本专利技术的实施例中，所述PCR反应体系和条件为：PCR反应体系为25μL，含2×PCRMastermix12.5μL，正/反向引物各3μL，DNA模板2μL，含20～50ngDNA，ddH2O补足25μL；PCR反应条件为：94℃下预变性2min；而后35个循环，每个循环包括94℃变性30s，41-51℃退火30s，72℃延伸30s；最后72℃延伸5min。蚋类分子鉴定引物的使用方法，其特征在于：所述使用1％琼脂糖电泳检测。下面结合具体实施例对本本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物，其特征在于，所述用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物序列：SEQ ID NO：1 TATGTACTACCATGAGGACAAATATC；SEQ ID NO：2 AGCAAATAAAAAATATCATTC。

【技术特征摘要】
1.一种用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物，其特征在于，所述用于蚋类昆虫
分类和鉴定的引物序列：
SEQIDNO：1TATGTACTACCATGAGGACAAATATC；
SEQIDNO：2AGCAAATAAAAAATATCATTC。
2.如权利要求1所述的用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物，其特征在于，所
述用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物片段370bp。
3.一种如权利要求1所述用于蚋类昆虫分类和鉴定的引物的制备方法，其
特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤一，总DNA的提取，采用试剂盒法，用100μL洗脱液溶解提取的样
品，采用核酸滴定仪测定提取DNA的浓度及纯度，进行样品检测或者置于-20℃
保存、备用；
步骤二，引物筛选，选出备选上游引物13条，下游引物13条，引物序列
SEQIDNO：1与SEQIDNO：2的组合；
步骤三，以所得基因组DNA为...

【专利技术属性】
技术研发人员：王刚，黄敏，黄波，张经常，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61