紫花苜蓿镰刀菌根腐病病原菌分离纯化与致病性鉴定方法技术
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物病原菌分析领域，特别是涉及一种紫花苜蓿病原菌分离纯化与致病性鉴定方法。
技术介绍
紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是世界上分布最广泛的多年生豆科牧草，由于产量高、品质优良使其具有“牧草之王”之美誉。苜蓿的另一大优势是一次种植可利用多年，由于利用年限较长，根腐病已成为产量下降和植株衰败的一个极其重要的原因。该病害是世界性病害，几乎在所有苜蓿产区都有发生，据估计，每年全世界由该病造成的产量损失在20％左右，有些严重发生的地块甚至达到40％。随着种植面积的增加和种植年限的延长，病害问题会越来越严重，不仅降低了苜蓿的产量，还降低了品质，有些甚至失去了加工和利用价值，同时也会给奶业带来隐患，因为根腐病的主要致病菌，如镰刀菌属(Fusariumspp.)的三线镰孢菌(F.tritinctum)和腐皮镰孢菌(F.solani)等菌种可以产生毒素。其中，玉米赤霉烯酮(zearalenone,ZEN)和脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivaleno,DON)是较为常见、影响较大的两种毒素。ZEN具有较强的生殖发育、免疫和细胞毒性，对肿瘤的产生也有一定...
【技术保护点】
一种紫花苜蓿镰刀菌根腐病病原菌分离纯化与致病性鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)苜蓿病株的采集与准备对苜蓿田进行定点调查，观察根腐病的田间症状，采集具有典型症状的镰刀菌根腐病病株标样；(2)病原菌的分离纯化于病株标样的病斑处切取小块组织，经处理后，纯化到种，再将分离纯化后的镰刀菌接到培养基中保存，用于后续的菌种鉴定；(3)病原菌形态学观察菌种培养一段时间后，依据培养基上的培养性状，包括菌落形态、色泽、菌落生长速度；通过VBC和SNA限定营养缺乏培养基上对大小分生孢子的有无、分生孢子的形态及产生方式、厚垣孢子的有无及着生方式进行形态鉴定；(4)分子生物学鉴定在形态学特...
【技术特征摘要】
1.一种紫花苜蓿镰刀菌根腐病病原菌分离纯化与致病性鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：(1)苜蓿病株的采集与准备对苜蓿田进行定点调查，观察根腐病的田间症状，采集具有典型症状的镰刀菌根腐病病株标样；(2)病原菌的分离纯化于病株标样的病斑处切取小块组织，经处理后，纯化到种，再将分离纯化后的镰刀菌接到培养基中保存，用于后续的菌种鉴定；(3)病原菌形态学观察菌种培养一段时间后，依据培养基上的培养性状，包括菌落形态、色泽、菌落生长速度；通过VBC和SNA限定营养缺乏培养基上对大小分生孢子的有无、分生孢子的形态及产生方式、厚垣孢子的有无及着生方式进行形态鉴定；(4)分子生物学鉴定在形态学特征鉴定的基础上对分离菌株的rDNA-ITS区域和TEF-1α序列进行扩增；扩增产物回收纯化，连接到载体中并转化大肠杆菌，阳性克隆送交测序，使用DNAMAN软件对测序结果进行剪切分析，剪切后在线比对分析；其中，rDNA-ITS又称为核糖体基因内转录间隔区域，TEF-1α又称为翻译延长因子1α基因；(5)进化树的构建将获得的ITS序列和TEF-1α的序列分别与GenBank数据库和鉴定镰刀菌的数据库FUSARIUM-ID中的镰刀菌的rDNA-ITS和TEF-1α序列进行比较，利用MEGA5软件进行聚类分析，构建系统发育树；(6)致病性鉴定于器皿中放置大小均匀的燕麦种子，加水浸泡过夜，除去多余水分，高压灭菌；器皿中加入接种菌株的琼脂块；直至燕麦种子完全接种镰刀菌后备用；选择饱满健康的苜蓿种子，消毒后置于培养皿中催芽，播于盆中培养成植株；待植株培养一段时间后，将提前准备好的燕麦接种于植株；不接种的植株作为对照；接种后培养一段时间，观察病害情况；根据病斑占根系面积的百分比进行病害分级；统计发病率DI和病害严重指数DSI；DI＝(病株数/总株数)×100％；DSI％＝∑(各级病株数×该级代表值)/(调查总株数×最重级别代表值)×100％；切取感病根组织，消毒后接种于PSA平板上进行分离和纯化，并采用上述形态学观察和分子鉴定的方法与最初的接种物进行比较和鉴定。2.根据权利要求1所述的紫花苜蓿镰刀菌根腐病病原菌分离纯化与致病性鉴定方法，其特征在于：步骤(2)中所述的切取的小块组织大小为5×5mm；所述处理的方法为75％的酒精处理30s，0.1％的升汞处理3min，无菌水冲洗3-5次；所述纯化到种的方法为PSA培养基上，25℃暗培养4d，挑取菌丝于PSA培养基上纯化3次，再经过MGA培养基纯化3次后...
【专利技术属性】
技术研发人员：丛丽丽，康俊梅，张铁军，龙瑞才，杨青川，
申请(专利权)人：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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