一种融合多肽制造技术

一种融合多肽具有催化葡萄糖氧化还原能力，其中该融合多肽包含一氨基酸序列，该氨基酸序列中包含γ‑亚单元，具有SEQ ID No.1、α‑亚单元，具有SEQ ID No.2、β‑亚单元，具有SEQ ID No.3以及两个由5‑15个氨基酸所组成的键结片段，分别连接γ‑亚单元、α‑亚单元以及β‑亚单元，或1至5个氨基酸残基被取代、删除、附加、插入或/和加成的该氨基酸序列。三个亚单元藉由键结片段，融合形成单一蛋白质，可增加酶对葡萄糖的专一性，且在不同温度下仍具有高度稳定性，单一蛋白质的纯化工艺更为简易，使得酶可快速大量制备，可作为血糖浓度测量仪主要检测组件。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种融合多肽。尤其是一种葡萄糖脱氢酶融合多肽。
技术介绍
葡萄糖脱氢酶〈glucosedehydrogenase,GDH〉为一常见生物酶，其可应用于血糖检测器，当作主要检测组件之一，因为葡萄糖与NAD经GDH反应生成NADH，藉由测量NADH可以回推换算得到血糖浓度。通常血糖检测器中的葡萄糖脱氢酶来自真菌及细菌。就酶的蛋白质基本结构来说，大多数酶是藉由共价键结的方式连接两个单体而以双体表达其蛋白质的特性。在葡萄糖脱氢酶对血糖的催化反应，过程中需联用不同辅酶当作电子转移的媒介，辅酶包含吡咯喹啉醌葡萄糖脱氢酶〈PQQ-GDH〉、黄素腺嘌呤二核苷酸葡萄糖脱氢酶〈FAD-GDH〉及烟酰胺腺嘌呤二核苷酸葡萄糖脱氢酶〈NAD-GDH〉。血糖透过联用辅酶以及葡萄糖脱氢酶催化脱氢，但是此机制还需要NAD+的参与，反应才能进行。如果使用quinoproteinglucosedehydrogenase〈quinoproteinGDH〉，则不需要氧气也不需要NAD+的参与即可测量血糖浓度。QuinoproteinGDH是一类特别的酶，它在邻醌类〈orthoquinone〉的参与下，可以广泛地氧化多种醇类与胺类。对quinoproteinGDH而言，可使用pyrroloquinolinequinine〈PQQ〉参与血糖催化反应。反应式为:葡萄糖+PQQ(氧化)－quinoprotein–GDH→葡萄糖酸内脂〈gluconolactone〉+PQQ(还原)。从催化反应机制来看，催化位置在C1的羟基。催化反应主要可分为两种机制：一是加成離去反应，而另一种反应为氢转移〈hydrogentransfer〉，不过两种反应机制皆需藉葡萄糖脱氢酶本身所拥有的辅酶或外加的辅酶负责电子转移。已知可用来测量血糖浓度的酶各有其优劣，例如，葡萄糖氧化酶〈glucoseoxidase,GOD〉对葡萄糖特异性高，不受其他糖类物质干扰，但是葡萄糖氧化酶易受氧气干扰。利用葡萄糖脱氢酶为检测组件的血糖仪无需氧的参与，不受氧气干扰。细菌的PQQ-GDH不能区分麦芽糖、半乳糖等糖类物质与葡萄糖，但是PQQ-GDH的活性相对较高。真菌的FAD-GDH不能区分木糖与葡萄糖，且活性较低。而细菌的FAD-GDH不能区分麦芽糖与葡萄糖但活性较高，且细菌的FAD-GDH可直接放出电子，不需经过电子传导媒介。目前市售葡萄糖催化酶是以葡萄糖氧化酶、PQQ-GDH和真菌的FAD-GDH为主，因此会有对葡萄糖专一性不足或易受其他物质干扰测量结果的问题。利用葡萄糖脱氢酶为检测组件的血糖仪可不受氧气干扰，但是脱氢酶包含至少三个单体，公知的脱氢酶合成方法先将单体各自由载体表达，再利用各单体间的范德华力(Vanderwaalsforce)相互吸引，然而单体在不同载体中的表达难以控制，且单体间的范德华力在经过后续步骤，如纯化步骤，单体间的结合状况亦不清楚，这些不确定因素皆会影响酶的葡萄糖氧化还原能力。
技术实现思路
鉴于上述课题，本专利技术旨在提供一种融合多肽具有催化葡萄糖氧化还原能力，其中该融合多肽包含一氨基酸序列，该氨基酸序列中包含γ-亚单元，具有SEQIDNo.1、α-亚单元，具有SEQIDNo.2、β-亚单元，具有SEQIDNo.3以及两个由5-15个氨基酸所组成的键结片段，分别连接γ-亚单元、α-亚单元以及β-亚单元，或1至5个氨基酸残基被取代、删除、附加、插入或/和加成的该氨基酸序列。根据本专利技术部分实施例，α-亚单元位置326处被谷氨酰胺所取代，位置365处被酪鞍酸所取代。根据本专利技术部分实施例，键结片段由8个甘氨酸所组成。根据本专利技术部分实施例，键结片段由甘氨酸以及丝氨酸所组成。根据本专利技术部分实施例，两键结片段的氨基酸序列不相同。根据本专利技术部分实施例，融合多肽的平均分子量介于121至126kDa之间。根据本专利技术部分实施例，氨基酸序列依序为SEQIDNo.1、该键结片段、SEQIDNo.2、该键结片段、SEQIDNo.3。本专利技术还提供一种血糖检测试片，具有一基板以及如前所述的融合多肽。本专利技术还提供一种多核苷酸，其编码出前述的融合多肽。根据本专利技术部分实施例，多核苷酸，依序包含：SEQIDNo.4，编码出该γ-亚单元；SEQIDNo.5，编码出该α-亚单元；以及SEQIDNo.6，编码出该β-亚单元。根据本专利技术部分实施例，由具有以下核苷酸序列编码出各该键结片段：GGXGGXGGXGGXGGXGGXGGXGGX，其中X为T、A、C或G。根据本专利技术部分实施例，多核苷酸包含SEQIDNo.7，编码出各所述的键结片段。本专利技术还提供一种载体，其包含如上述的多核苷酸。本专利技术还提供一种宿主细胞，其包含如上述的载体。根据本专利技术部分实施例，三个亚单元藉由键结片段，融合形成单一蛋白质，可增加酶对葡萄糖的专一性，且在不同温度下仍具有高度稳定性，单一蛋白质的纯化工艺更为简易，使得酶可快速大量制备，可作为血糖浓度测量仪主要检测组件。附图说明本专利技术上述和其他方面以及特征将参照说明书内容并配合附图得到更清楚的了解，其中：图1绘示依照本专利技术实施方式的一种融合多肽示意图。图2根据本专利技术实施例的一种融合多肽蛋白质印迹法图示。图3A绘示一市售酶在不同温度下的稳定性。图3B绘示根据本专利技术实施例的一种融合多肽在不同温度下的稳定性。具体实施方式为了使本揭示内容的叙述更加详尽与完备，下文针对了本专利技术的实施态样与具体实施例提出了说明性的描述；但这并非实施或运用本专利技术具体实施例的唯一形式。以下所揭露的各实施例，在有益的情形下可相互组合或取代，也可在一实施例中附加其他的实施例，而无须进一步的记载或说明。在以下描述中，将详细叙述许多特定细节以使读者能够充分理解以下的实施例。然而，可在无此等特定细节的情况下实践本专利技术的实施例。葡萄糖脱氢酶〈glucosedehydrogenase,GDH〉可用于生物传感器〈biosensors〉，属于催化型〈catalysis〉生物辨识组件。利用葡萄糖脱氢酶的催化能力与目标物选择性，可检测血糖代谢所产生的变化或代谢产物，再将信号转换成电子信号后以数据方式呈现。根据本专利技术部分实施例，提供一种具有催化葡萄糖氧化还原反应的融合多肽，其原始序列来源物种为Burkholderiacepacia。以下所提及的蛋白质、修饰蛋白质、变异体等皆以原始序列为基础。参照图1。图1是根据本专利技术部分实施例的一融合多肽示意图。一融合多肽10包含三个亚单元11、13及15，融合多肽10还包含两键结片段17、19，各自将三个亚单元11、13及15结合形成单一蛋白质，可具有催化葡萄糖脱氢反应的活性。融合多肽10因键结片段组合不同，其平均总分子量介于121,000至126,000道尔顿的间〈121kDa–126kDa〉。本专利技术的融合多肽包含一氨基酸序列，将亚单元融合于单一氨基酸序列，使得脱氢酶各单体可透过一次性的表达即形成蛋白质结构，免去各个单体在载体上分开表达的不稳定性，可确保脱氢酶的功能性且增加脱氢酶于表达载体上的产量。根据本专利技术部分实施例，融合多肽10其中一亚单元为γ-亚单元11，γ-亚单元11由约169个氨基酸组成，平均分子量约为18,000道尔顿〈18kDa〉。γ-亚单元11具有氨基酸序列SEQIDNo.1。γ-亚本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合多肽，其特征在于，所述的融合多肽具有催化葡萄糖氧化还原能力，所述的融合多肽包含：一氨基酸序列，所述的氨基酸序列包含：γ‑亚单元，具有SEQ ID No.1；α‑亚单元，具有SEQ ID No.2；β‑亚单元，具有SEQ ID No.3；以及两个由5‑15个氨基酸所组成的键结片段，分别连接γ‑亚单元、α‑亚单元以及β‑亚单元；或1至5个氨基酸残基被取代、删除、附加、插入或/和加成的所述的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
2016.01.04 TW 105100031;2015.07.14 US 62/192,0741.一种融合多肽，其特征在于，所述的融合多肽具有催化葡萄糖氧化还原能力，所述的融合多肽包含：一氨基酸序列，所述的氨基酸序列包含：γ-亚单元，具有SEQIDNo.1；α-亚单元，具有SEQIDNo.2；β-亚单元，具有SEQIDNo.3；以及两个由5-15个氨基酸所组成的键结片段，分别连接γ-亚单元、α-亚单元以及β-亚单元；或1至5个氨基酸残基被取代、删除、附加、插入或/和加成的所述的氨基酸序列。2.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述的α-亚单元位置326处被谷氨酰胺所取代，位置365处被酪鞍酸所取代。3.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，各所述的键结片段由8个甘氨酸所组成。4.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，各所述的键结片段由甘氨酸以及丝氨酸所组成。5.如权利要求1所述的融合多肽，其特征在于，所述的两键结片段的氨基酸序列不相同。6.如权利要求1所述的融合多肽，其特征...

【专利技术属性】
技术研发人员：马念涵，林桢桓，苏星显，陈师庆，
申请(专利权)人：达尔生技股份有限公司，中央大学，
类型：发明
国别省市：中国台湾;71