本发明专利技术涉及植物组培领域，特别涉及一种北五味子的扩繁方法，包括以下步骤：将消毒后的北五味子休眠芽暗培养，得到愈伤组织；将愈伤组织切割，培养得到胚性愈伤组织；将胚性愈伤组织进行生物反应器暗培养诱导体细胞胚，得到球形胚；进行体细胞胚的萌发培养，得到生根苗；生根苗移栽到珍珠岩和草炭重量比为1:2.8‑3.2的基质培养基中，培养后进行移栽。本发明专利技术利用体细胞胚发生途径获得北五味子再生植株，实现了北五味子植株的快速扩繁，培养时间缩短，培养效率提高，可以大规模的获得植株，有助于进行品种化生产；并且再生植株与母本具有高度一致性，遗传稳定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及植物组培领域，具体而言，涉及一种北五味子的扩繁方法。
技术介绍
北五味子是我国东北部名贵的道地药材，主产于东北三省及内蒙、河北等地，其果实可以入药，味酸、甘，性温，具有收敛固涩，益气生津，补肾宁心的功效。北五味子除药用外，还可用于饮料和保健品，深受国内外消费者的青睐。随着北五味子需求量逐步增加，北五味子的人工栽培面积急剧扩大，但由于目前育成的优良品系较少，野生五味子种子培育的实生苗生物学特性以及品质等群体间变异较大，丰产稳产性极差，良种繁育体系欠缺，严重制约了北五味子栽培业的发展。现有技术主要采用以下两种方式进行繁殖：一、利用带腋芽的嫩茎段进行组培快繁；但这种繁殖方式生根率极低并且丛生芽扩繁几次后出现大面积死亡。二、利用种子无菌播种苗的下胚轴进行体细胞胚诱导；该方式存在以下缺陷：由种子产生的后代遗传特性不稳定，不能够遗传母本优良品质。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种北五味子植株的扩繁方法，该方法通过胚性愈伤组织的扩繁和体细胞胚的诱导，可以缩短培养时间，提高培养效率；并且再生植株与母本具有高度一致性，遗传稳定。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种北五味子植株的扩繁方法，包括以下步骤：(a)、将消毒后的北五味子休眠芽放入诱导培养基进行暗培养，得到愈伤组织；(b)、将所述愈伤组织切割，然后放入诱导胚性愈伤组织培养基中进行培养，得到胚性愈伤组织；(c)、将所述胚性愈伤组织转移到液体培养基中进行暗培养诱导体细胞胚，得到球形胚；(d)、将所述球形胚转移到半固体培养基上进行体细胞胚的萌发培养，得到生根苗；(e)、将所述生根苗移栽到珍珠岩和草炭重量比为1:2.8-3.2的基质培养基中，培养后进行移栽；其中，所述诱导培养基的成分如下：MS培养基中含有2,4-D1.8-3.2mg/L、TDZ 0.15-0.25mg/L、蔗糖28-32g/L以及琼脂6.5-7.5g/L，pH为5.7-6.0。本专利技术提供的一种北五味子植株的扩繁方法，先对北五味子的休眠芽诱导培养得到愈伤组织，诱导率为95％以上；然后将愈伤组织进行切割，进行胚性愈伤组织的诱导，胚性愈伤组织诱导得到的体细胞胚再进行萌发得到生根苗，即本专利技术利用体细胞胚发生途径获得北五味子再生植株，实现了北五味子植株的快速扩繁，培养时间缩短，培养效率提高，可以大规模的获得植株，有助于进行品种化生产；并且再生植株与母本具有高度一致性，遗传稳定。其中，诱导培养基中的2,4-D在MS培养基中的含量可以为1.8mg/L、2.2mg/L、2.5mg/L、3mg/L、3.2mg/L等等。优选地，在步骤(a)中，所述消毒为：取北五味子休眠芽体，先在自来水下冲洗，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒28-35秒，再用0.1％升汞消毒18-22分钟，最后用无菌水冲洗3-4次，剥去外鳞片即得所述消毒后的北五味子休眠芽。通过逐步的消毒，以得到无菌的并且无损伤的北五味子休眠芽，以便于下一步的诱导培养。外鳞片一般通过无菌的镊子和刀片进行剥除。暗培养一般在盛有30-40ml诱导培养基的100ml的三角瓶进行，每个三角瓶中一般放置3-4个消毒的休眠芽，然后进行暗培养。为了暗培养得到的愈伤组织活力强，分化能力强，易于存活，优选地，在步骤(a)和步骤(c)中，所述暗培养的温度为25±2℃，所述暗培养的时间为25-30天。本专利技术中，采用以上诱导培养基培养，一个休眠芽诱导得到的愈伤组织为0.5±0.025g。为了诱导胚性愈伤组织得到的胚性愈伤组织活力强，分化能力强，易于存活，优选地，在步骤(b)中，所述诱导胚性愈伤组织培养基的成分如下：MS培养基中含有2,4-D 2.8-3.2mg/L、蔗糖28-32g/L以及琼脂6.5-7.5g/L，pH为5.7-6.0。同样地，优选地，在步骤(b)中，所述愈伤组织切割的大小为0.35-0.55cm×0.35-0.55cm，所述培养的时间为25-30天。本专利技术中，采用以上诱导胚性愈伤组织培养基培养，以每个休眠芽计，得到的胚性愈伤组织为0.2±0.01g。优选地，在步骤(c)中，所述液体培养基的成分如下：1/2浓度的MS培养基中含有蔗糖18-22g/L；所述暗培养的温度为25±2℃，培养时间为40-45天。液体培养基培养是在气升式生物反应器中进行，气升式生物反应器的结构如图1所示，具体地，包括依次连接的电源插头1、气泵2、空气流量计3、过滤膜4、多孔喷嘴5、培养容器6、导管7、导管经过过滤膜4将气体排出；图1中箭头方向指示气体的进出方向。使用气升式生物反应器对胚性愈伤组织进行暗培养诱导体细胞胚，在培养的过程中通过通入过滤过的空气以满足植物生长需求，空气的通入量为0.2-0.3vvm，利用气流所引起的液体不断流动搅拌使植物组织能充分均匀的吸收营养物质，从而达到生长阶段同步均一的效果，并且提高诱导率；另外，培养基不需要加入琼脂，使生产成本降低60％；目前我们在用的最小的气升式生物反应器为3L，与固体培养基(每瓶培养基为50mL)相比操作简便，提高工作效率，节省劳动力成本。本专利技术中，采用以上液体培养基培养，以每个休眠芽计，得到的体细胞胚的个数为68±3个。优选地，在步骤(d)中，所述半固体培养基的成分如下：MS培养基中含有蔗糖28-32g/L，琼脂6.5-7.5g/L，pH为5.7-6.0。经验证，该培养基进行体细胞胚的萌发培养萌发率高，得到的生根苗更为健壮。本专利技术中，采用以上半固体培养基培养，以每个休眠芽计，得到的生根苗为34±2棵。为了便于移植，并提高存活率，得到的所述生根苗有3-4片叶。进一步地，在步骤(b)和(d)中，所述培养的条件为：培养温度为25±2℃，光照时间为15-16小时/天。经验证，步骤(b)和(d)以该培养条件进行培养，各组织能得到很好的生长。进一步地，在步骤(e)中，所述生根苗移栽前先用水冲洗掉培养基，然后移栽至盛有所述述基质培养基的容器中，然后用塑料袋将容器罩上，放在温室内，温室保持在25±2℃，光照时间为15-16小时/天。先进行套袋培养，以提高成活率，待该植株适应环境后，长出新叶，去掉塑料袋，进行移栽。本专利技术中，以每个休眠芽计，得到的可移栽苗为24-28棵。进一步地，所述北五味子的品种为嫣红、早红、金五味1号中的任一种。经验证，以上品种的北五味子诱导得到的再生植株与母本性状高度一致，且遗传稳定。进一步地，步骤(b)中得到的胚性愈伤组织还包括：保存或继代培养的步骤，然后再将得到的胚性愈伤组织进行后续步骤；其中，所述继代培养或保存所用的培养基的成分为：MS培养基中含有2,4-D 0.8-2.2mg/L、蔗糖28-32g/L以及琼脂6-7g/L，pH为5.7-6.0。即本专利技术中得到的胚性愈伤组织可以直接进行后续的步骤，也可以直接进行继代培养以使胚性愈伤组织进行扩繁和保存再进行后续的步骤。继代培养和保存的条件均为：在温度为25±2℃进行培养，光照时间为15小时/天，每28-35天继代一次。经多次试验，本专利技术采用继代培养后得到的胚性愈伤组织仍具有扩繁和产生体细胞胚的能力，并且每次继代培养的扩繁系数均为6倍以上，且对后续步骤基本无影响。并且已验证继代保存一年多仍具本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)、将消毒后的北五味子休眠芽放入诱导培养基进行暗培养，得到愈伤组织；(b)、将所述愈伤组织切割，然后放入诱导胚性愈伤组织培养基中进行培养，得到胚性愈伤组织；(c)、将所述胚性愈伤组织转移到液体培养基中进行暗培养诱导体细胞胚，得到球形胚；(d)、将所述球形胚转移到半固体培养基上进行体细胞胚的萌发培养，得到生根苗；(e)、将所述生根苗移栽到珍珠岩和草炭重量比为1:2.8‑3.2的基质培养基中，培养后进行移栽；其中，所述诱导培养基的成分如下：MS培养基中含有2,4‑D1.8‑3.2mg/L、TDZ 0.15‑0.25mg/L、蔗糖28‑32g/L以及琼脂6.5‑7.5g/L，pH为5.7‑6.0。
【技术特征摘要】
1.一种北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，包括以下步骤：(a)、将消毒后的北五味子休眠芽放入诱导培养基进行暗培养，得到愈伤组织；(b)、将所述愈伤组织切割，然后放入诱导胚性愈伤组织培养基中进行培养，得到胚性愈伤组织；(c)、将所述胚性愈伤组织转移到液体培养基中进行暗培养诱导体细胞胚，得到球形胚；(d)、将所述球形胚转移到半固体培养基上进行体细胞胚的萌发培养，得到生根苗；(e)、将所述生根苗移栽到珍珠岩和草炭重量比为1:2.8-3.2的基质培养基中，培养后进行移栽；其中，所述诱导培养基的成分如下：MS培养基中含有2,4-D1.8-3.2mg/L、TDZ 0.15-0.25mg/L、蔗糖28-32g/L以及琼脂6.5-7.5g/L，pH为5.7-6.0。2.根据权利要求1所述的北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述消毒为：取北五味子休眠芽体，先在自来水下冲洗，然后在超净工作台上用70％的酒精消毒28-35秒，再用0.1％升汞消毒18-22分钟，最后用无菌水冲洗3-4次，剥去外鳞片即得所述消毒后的北五味子休眠芽。3.根据权利要求1所述的北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，在步骤(a)和步骤(c)中，所述暗培养的温度为25±2℃，所述暗培养的时间为25-30天。4.根据权利要求1所述的北五味子植株的扩繁方法，其特征在于，在步骤(b)中，所述诱导胚性愈伤组织培养基的成分如下：MS培养基中含有2,4-D 2.8-3.2mg/L、蔗糖28-32g/L以及琼脂6.5-7.5g/L，pH为5.7-6.0。5.根据权利要求4所述...
【专利技术属性】
技术研发人员：孙丹，艾军，王振兴，秦红艳，许培磊，赵滢，范书田，杨义明，王春伟，
申请(专利权)人：中国农业科学院特产研究所，
类型：发明
国别省市：吉林;22
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