确定组织放射敏感性的预测方法技术

一种通过取自患者未辐照区域或微量辐照区域的细胞样品预测该患者对电离束的细胞敏感性的方法，其中：(i)扩增所述取样的细胞，所述扩增的细胞构成“细胞样品”；(ii)在所述细胞样品上，在观测时间t通过标记物pH2AX获得核灶平均数(该平均数称为NpH2AX(t))，所述观测时间t为时间t＝0分钟(称为t0，未经辐照状态)以及用吸收剂量D辐照后的观测时间t4；(iii)至少使用参数NpH2AX(t4)确定以戈瑞(Gy)表示的不能被超过的总剂量(TDNTBE)；并且在该方法中：t4是表示DNA断裂率达到其残余值的时间。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及医学放射生物学领域，具体涉及放射生物学实验室方法领域。本专利技术涉及一种用于预测细胞、组织和临床放射敏感性的新方法，该方法基于多种参数、细胞的和酶的标准的测定和相关性。
技术介绍
约1％至15％通过放疗治疗癌症的患者会有组织反应(如皮炎或直肠炎)，这可能会导致医生在既定方案完成之前就决定停止放疗治疗。另外，这种组织反应是患者对电离辐射的超高敏感性的指标。因此，即使是在可见的组织标记物首次出现之前就中断这种放疗治疗，也可能会增加发病率或者甚至是增加患者治疗后的死亡率，不仅因为过早中断治疗使得不能完全根除想要治疗的癌症，也因为辐射本身会对健康组织造成继发性损害。众所周知，组织对电离辐射的敏感性问题与DNA损伤修复机制是分不开的。事实上，在细胞水平上，电离辐射可能会使某些类型的化学键断裂、产生自由基(尤其是通过过氧化)和其他由DNA损伤产生的其他活性物质。由内源性或外源性应激(如由电离辐射和自由基)所导致的DNA损伤，可能导致不同类型的DNA功能损伤，特别是，根据所施加的能量的DNA损伤：碱基损伤、单链断裂和双链断裂(DSB)。未修复的DSB与细胞死亡、毒性、以及更具体地说，放射敏感性相关。修复差的DSB与基因组不稳定性、致突变现象和癌症易感性有关。生物体对每种类型的DNA损伤都有特定的修复系统。关于双链断裂，哺乳动物有两种主要的修复模式：缝合修复(链连接)和重组修复(插入同源或非同源链)。众所周知，在不同器官之间以及不同个体之间，组织对电离辐射的敏感性高度可变；1981年，由Fertil和Malaise提出了“内在放射敏感性”的概念。因此，各种针对放疗的疗效和副作用的各种研究已经表明，有些个体具有很高的抗放射性，相反，有些个体则可能表现出放射敏感性，该敏感性的范围可以从临床上确认到但副作用不严重到造成致死作用。即使排除某些罕见的极端敏感的案例，通过其遗传起源似乎可以认为放射敏感性一般源于遗传易感性：因此其因人而异。因此为了能够确定特定患者在无风险的情况下可接受的最大累积剂量，期望存在一种预测试验方法。这一问题首先在高电离剂量背景下的放疗中提出。然而，该问题也有可能在任何其他与放疗中使用的等同的高电离剂量的暴露中提出。众所周知，通常称为ATM和ATR的激酶家族中的两种蛋白参与DSB的检测、修复和信号转导；它们的行动至少需要存在一种称为BRCA1的蛋白，和不同ATM底物磷酸化的有序级联(见N.Foray等发表在EMBO杂志22卷(11)，p.2860-2871(2003)的文章“A subset of ATM-and ATR-dependent phosphorylation events requires the BRCA 1protein”)。在细胞放射敏感性的解释性模型中尝试使用ATM酶进行试验(参见Joubert等,“DNA double-strand break repair defects in syndromes associated with acute radiation response；At least two different assays to predict intrinsic radiosensitivity？”,发表于lnt.J.Radiat.Biol.,vol.84(2),p.107-125(2008))，并且该试验能够鉴定三种类型的放射敏感性：抗放射性细胞(I类放射敏感性)、中度放射敏感细胞(II类放射敏感性)和极度放射敏感细胞(III类放射敏感性)。然而，在此基础上并未提出预测模型，特别是没有建立临床数据(组织严重等级)和放射生物学数据之间的关系。同样，2008年1月25日N.Foray在“Rencontres Nucléaire&Santé”会议(XP55131242)上所做的报告“Les réparatoses:nouveaux concepts sur la prédiction de la radiosensibilité”中说明了不同标记物pH2AX和MRE11的作用以及其随时间的变化为了，用于描述辐射诱导双链断裂的数量。该综述未提及用于定量和识别临床水平观察到的放射敏感性等级的组织严重等级。多篇文献描述了ATM可以用于检测和修复DNA损伤的条件。专利申请WO 2004/013634(KUDOS制药有限公司)描述了ATM依赖型DNA损伤信号转导通路的识别，其与包括MRE11/Rad51/NBS1复合体在内的其他DNA损伤的响应因子相互作用。专利申请US 2007/0072210(Ouchi和Aglipay)提出了一种筛选促进应对DNA损伤响应的潜在治疗试剂的方法，其中将名为BAAT1的蛋白(其与乳腺癌易感基因BRCA1相关)与ATM蛋白及候选化合物混合；如果相对于不含候选化合物的对照混合物来说ATM磷酸化增加，则鉴定后者是促进DNA修复的潜在有效成分。专利申请EP 2 466 310 A1(慕尼黑亥姆霍兹中心)描述了在组蛋白H2AX的磷酸化形式(称为γ-H2AX或g-H2AX)存在下的DNA双链断裂修复。专利申请WO 00/47760和专利US 7 279 290(圣裘德儿童研究医院)描述了ATM激酶功能在DNA修复中的作用。由此，这些最后的文献描述了修复途径，但并未提供任何建立临床关联的相关性。专利EP 1 616 011 B1(国际遗传工程和生物技术中心)提出了一种诊断DNA修复中的遗传缺陷的方法，该方法基于以下三个步骤：培养从待测样品中分离的细胞，用嵌合多肽孵育所述细胞，以及表征细胞响应。所述细胞响应是指构成以下类型的细胞内蛋白的生化标记物的表达水平：p53、ATM、Chk1、Chk2、BRCA1、BRCA2、Nbs1、MRE11、Rad50、Rad51和组蛋白。然而，辐射诱导的表达无法预测所述蛋白的功能(某些症状中蛋白突变时其表达水平正常)：这些程序不是功能试验。专利申请WO 01/90408、WO2004/059004和WO 2006/136686(法国原子能委员会)描述了观察电离辐射后DNA损伤的其他方法。第一篇文献关注于DNA损伤切口的活性的证明，但不能定量DNA切除和再合成的酶活性，也不能定量DSB的修复。其他两篇文献描述了通过环状超螺旋双链DNA定量评估生物介质修复其DNA的能力(根据第三篇文献：在多孔聚丙烯酰胺水凝胶膜中固化)。这些方法并未直接关注生理环境中的原位DSB，并且也没有验证其临床应用的相关性。KR20030033519提出了由催化剂或超氧化物歧化酶的活性推导放射敏感性的方法，并且KR20030033518中使用了谷胱甘肽过氧化物酶或葡萄糖6-磷酸脱氢酶。这些方法没有检测与DNA损伤或修复直接相关的标记物。专利申请US 2011/312514(Dana Farber癌症研究所)提出用FANCD2灶(foci)作为检测标记物。专利申请US 2007/0264648(美国国家放射科学研究所)提出了DNA寡聚物在预测放疗过程中是否出现副作用的用途。然而，当FANCD2灶水平正常时，也可以观察到某类的放射敏感性。专利申请US 2008/234946和US 2012/041908(南本文档来自技高网...

【技术保护点】
预测细胞样品对电离辐射的细胞放射敏感性的方法，所述细胞样品获得自由患者未经辐照或只经轻微辐照区域内取样的细胞，在该方法中：(i)扩增所述取样的细胞，所述扩增的细胞构成“细胞样品”；(ii)在所述细胞样品上，在观测时间t，通过标记物pH2AX确定得到的核灶平均数(该平均数称为NpH2AX(t))，所述观测时间t为时间t＝0分钟(称为t0，未经辐照状态)以及用吸收剂量D辐照后的观测时间t4(并优选也包括时间点t1、t2和t3)；(iii)至少使用参数NpH2AX(t4)确定以戈瑞(Gy)表示的不能被超过的总剂量(TDNTBE)，并且在该方法中：—t4是固定值，表示DNA断裂水平达到其残余值的时间，并且t4有利地在t3的6倍至t3的8倍之间选择，但在该情况下必须至少为12小时，并优选在12小时至48小时之间，并且更优选为大约24小时；—t3是固定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞中大约25％DSB修复后的时间，并且t3有利地在t2的3倍至t2的5倍之间选择，但在该情况下必须至少为2.5小时且至多为6小时，并优选在3小时至5小时之间，并且更优选为大约4小时；—t2是固定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞中大约50％DSB修复后的时间，并且t2有利地在t1的5倍至t1的7倍之间选择，但在该情况下必须至少为35分钟且至多为90分钟，并优选在45分钟至75分钟之间，并且更优选为大约60分钟；—t1是固定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞中，识别的DSB数量达到其最大值后的时间，并且t1有利地在辐照结束后的5分钟至15分钟之间选择，并优选在7.5分钟至12.5分钟之间，甚至更优选为大约10分钟。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2014.02.17 FR 1451216;2014.02.17 FR 1451215;2014.11.预测细胞样品对电离辐射的细胞放射敏感性的方法，所述细胞样品获得自由患者未经辐照或只经轻微辐照区域内取样的细胞，在该方法中：(i)扩增所述取样的细胞，所述扩增的细胞构成“细胞样品”；(ii)在所述细胞样品上，在观测时间t，通过标记物pH2AX确定得到的核灶平均数(该平均数称为NpH2AX(t))，所述观测时间t为时间t＝0分钟(称为t0，未经辐照状态)以及用吸收剂量D辐照后的观测时间t4(并优选也包括时间点t1、t2和t3)；(iii)至少使用参数NpH2AX(t4)确定以戈瑞(Gy)表示的不能被超过的总剂量(TDNTBE)，并且在该方法中：—t4是固定值，表示DNA断裂水平达到其残余值的时间，并且t4有利地在t3的6倍至t3的8倍之间选择，但在该情况下必须至少为12小时，并优选在12小时至48小时之间，并且更优选为大约24小时；—t3是固定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞中大约25％DSB修复后的时间，并且t3有利地在t2的3倍至t2的5倍之间选择，但在该情况下必须至少为2.5小时且至多为6小时，并优选在3小时至5小时之间，并且更优选为大约4小时；—t2是固定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞中大约50％DSB修复后的时间，并且t2有利地在t1的5倍至t1的7倍之间选择，但在该情况下必须至少为35分钟且至多为90分钟，并优选在45分钟至75分钟之间，并且更优选为大约60分钟；—t1是固定值，表示在取自抗放射性患者的对照组细胞中，识别的DSB数量达到其最大值后的时间，并且t1有利地在辐照结束后的5分钟至15分钟之间选择，并优选在7.5分钟至12.5分钟之间，甚至更优选为大约10分钟。2.根据权利要求1所述的方法，其中100个细胞在时间t观察到的微核平均数[用％表示](所述平均数被称为NMN(t))，至少为t0(未经辐照)和用吸收剂量D辐照后的t4的时间t，以及参数NMN(t4)用于确定TDNTBE。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中TDNTBE的确定：根据公式：TDNTBE＝60/NpH2AX(t4)，如果NpH2AX(t0)≤3，或根据公式：TDNTBE＝60/[NpH2AX(t4)+NpH2AX(t0)]，如果NpH2AX(t0)>3。4.根据权利要求2或3所述的方法，其中TDNTBE...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼古拉斯·福雷，阿德琳·格兰佐托，克莱芒·德维克，
申请(专利权)人：克劳德贝尔纳里昂第一大学，法国国家科学研究中心，莱昂贝拉尔德中心，国家健康和医学研究院，
类型：发明
国别省市：法国;FR