本发明专利技术公开的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针具有式(1)所示的结构。其制备步骤包括：将聚乙二醇接枝到壳聚糖上得到适于血液长循环的聚乙二醇‑壳聚糖，再将四苯基乙烯荧光分子标记到壳聚糖链上得到具有聚集诱导发光特性的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针。本发明专利技术制得的荧光探针具有灵敏度高，光稳定性好，高浓度时无淬灭，荧光光谱不漂移等优点，适于血液长循环，在细胞示踪、肿瘤诊断、药物代谢检测等领域具有广泛的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种壳聚糖基荧光探针及其制备方法，尤其是具有聚集诱导发光特性的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针及其制备方法。
技术介绍
壳聚糖(CS)作为一种富含氨基的天然多糖，具有良好的生物相容性和生物活性，无毒且易于生物降解，被广泛应用于生物医学领域。但是壳聚糖分子带正电，会引起细胞毒性和体内免疫反应，用聚乙二醇(PEG)修饰来掩蔽部分正电荷，可以降低血液循环过程中与内源性阴离子物质的非特异性结合，并且可以提高壳聚糖的水溶性从而延长壳聚糖分子的血液循环时间，因此PEG化壳聚糖能实现血液中的长循环。荧光探针是以荧光物质作为指示剂，并在一定波长光的激发下使指示剂产生荧光，通过检测所产生的荧光实现对被检测物质的定性或者定量分析。当前，荧光探针主要应用于生物、医学等领域，然而传统的荧光探针面临着聚集诱导淬灭(ACQ)效应和细胞毒性两大问题。聚集诱导发光(AIE)荧光分子的发现无疑提供了一种解决上述问题的思路。AIE效应使得荧光探针易于使用，并且AIE体系对细胞没有毒性，不会影响细胞生理学和细胞增殖。因此，制备一种适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针分子具有重要的科学意义和良好的应用前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有聚集诱导发光特性的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针及其制备方法。本专利技术的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针，其特征在于具有式(1)所示的结构，本专利技术的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针的制备方法，包括以下步骤：1)在N2气氛下，将1g粘均分子量为1万—100万，脱乙酰度为60％—95％的壳聚糖和2.30g邻苯二甲酸酐加入到40ml N,N-二甲基甲酰胺中，在130℃下反应5-7小时，倒入冰水中沉淀，抽滤，沉淀用甲醇抽提，真空干燥，得到N,O-邻苯甲酰化壳聚糖；2)将1.2g N,O-邻苯甲酰化壳聚糖加入到100ml N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中，N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为95：5，在氮气氛围中加热到120℃，充分搅拌后，将产物置于冰水沉淀，抽滤，用甲醇抽提，真空干燥，得到N-邻苯甲酰化壳聚糖；3)将0.5g N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于30ml质量浓度为5％氯化锂的N,N-二甲基乙酰胺溶液，于0℃下预冷，备用；将9.5ml三乙胺和3.6g对甲苯磺酰氯溶于20ml N,N-二甲基乙酰胺溶剂中，然后滴至上述备用的预冷液中，在4-8℃下充分反应，将产物置于冰水中沉淀，过滤，用氯仿洗涤，常温下真空干燥，得到6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖；4)将0.20g 6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖和1.30g叠氮化钠加入到30ml N,N-二甲基甲酰胺中溶解，80℃下充分反应，浓缩后滴加到蒸馏水中沉淀，过滤，真空干燥，得到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖；5)称取5g分子量为2000、甲基封端的聚乙二醇溶于20ml二氯甲烷，在0℃下边搅拌边加入0.15g氰化钠，待充分反应后再加入0.4ml溴丙炔，保持0℃继续搅拌至少2小时，然后加热到室温继续搅拌反应，将反应结束后的混合物置于水中，用二氯甲烷萃取，将萃取液蒸发后用苯溶解，乙醚沉淀，过滤，产物用乙醚洗涤，干燥，得到炔基-聚乙二醇；6)将4.6mg五水硫酸铜溶于2ml水，7.3mg抗坏血酸钠溶于2ml水，0.28g-1.11g炔基-聚乙二醇溶于10ml水，分别配制成五水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚乙二醇水溶液；将0.12g 6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于15ml二甲亚砜，得到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖的二甲亚砜溶液，将上述配制的五水硫酸铜水溶液、抗坏血酸钠水溶液和炔基-聚乙二醇水溶液加入到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖的二甲亚砜溶液中，在55℃下搅拌，充分反应后，蒸发除去其中的水；再在N2保护下，加入1ml一水合肼，在80℃搅拌反应，所得溶液用水透析除去杂质，之后浓缩，真空干燥，得到聚乙二醇-壳聚糖；7)称取1.5g聚乙二醇-壳聚糖加入到10mL二甲亚砜中，60℃下溶胀，然后加入含异硫氰酸酯官能团的四苯基乙烯衍生物TPE-ITC，TPE-ITC/聚乙二醇-壳聚糖的摩尔比为1％-25％，继续搅拌，充分反应，将反应液放入透析袋中，先用体积比为1:1的四氢呋喃与水的混合溶液透析，再用水透析，除去杂质，冻干法干燥，得到适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针。本专利技术通过将聚乙二醇(PEG)接枝壳聚糖上得到适于血液长循环的聚乙二醇-壳聚糖(PEG-CS)，再将四苯基乙烯(TPE)荧光分子标记到壳聚糖链上从而制得具有聚集诱导发光特性的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针分子PEG-CS-TPE。PEG接枝率为20％-80％；TPE标记率为0.75％-10.12％。本专利技术的优点在于：1)荧光探针具有聚集诱导发光特性，与传统荧光探针相比，具有灵敏度高，光稳定性好，高浓度时无淬灭，荧光光谱不漂移等优点，成像效果佳。有望应用于细胞示踪、癌症诊断、药物代谢检测等领域。2)壳聚糖分子带正电，会引起细胞毒性和体内免疫反应，用PEG修饰来掩蔽部分正电荷，可以降低血液循环过程中与内源性阴离子物质的非特异性结合，从而延长壳聚糖分子的血液循环时间，因此PEG化壳聚糖能实现血液中的长循环。具体实施方式以下结合实例进一步说明本专利技术。实施例1：1)在N2气氛下，向三口瓶中加入1g粘均分子量为1万，脱乙酰度为60％的壳聚糖(CS)和2.30g邻苯二甲酸酐，加入40ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，在130℃下反应5小时，将其倒入冰水中沉淀，抽滤后将沉淀用甲醇抽提24小时，在40℃下真空干燥，得到N,O-邻苯甲酰化壳聚糖。2)将1.2g N,O-邻苯甲酰化壳聚糖加入到100ml N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中，N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为95：5，在氮气氛围中加热到120℃，充分搅拌后，将产物置于冰水沉淀，抽滤，用甲醇抽提24小时，在40℃下真空干燥，得到N-邻苯甲酰化壳聚糖；3)将0.5g N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于30ml质量浓度为5％氯化锂的N,N-二甲基乙酰胺溶液，于0℃下预冷，备用；将9.5ml三乙胺和3.6g对甲苯磺酰氯溶于20ml N,N-二甲基乙酰胺(DMAc)中，然后滴至上述备用的预冷液中，保持4℃反应12小时。将产物置于冰水中沉淀，过滤，用氯仿洗涤，常温下真空干燥，得到6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖；4)将0.20g 6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖和1.30g叠氮化钠加入到30ml N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中溶解，80℃下反应24小时，浓缩后缓慢滴加到蒸馏水中沉淀，过滤，40℃下真空干燥，得到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖；5)称取5g分子量为2000、甲基封端的聚乙二醇(MPEG-2000)溶于20ml二氯甲烷，在0℃下边搅拌边加入0.15g氰化钠(NaH)。搅拌30分钟后再加入0.4ml溴丙炔，保持0℃继续搅拌2小时，然后加热到室温继续搅拌22小时，将反应结束后的混合物置于水中，用二氯甲烷萃取，将萃取液蒸发后用20ml苯溶解，倒入200ml乙醚中，过滤，产物用乙醚洗涤，并在室温下干燥，得到炔基-聚乙二醇；6)将4.6mg五水硫酸铜溶于2ml水，7.3mg抗坏血酸钠溶于2ml水，0.28g炔基-聚乙本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针，其特征在于具有式(1)所示的结构，。
【技术特征摘要】
1.一种适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针，其特征在于具有式(1)所示的结构，。2.制备权利要求1所述的适于血液长循环的壳聚糖基荧光探针的制备方法，其特征在于包括以下步骤：1)在N2气氛下，将1g粘均分子量为1万—100万，脱乙酰度为60％—95％的壳聚糖和2.30g邻苯二甲酸酐加入到40ml N,N-二甲基甲酰胺中，在130℃下反应5-7小时，倒入冰水中沉淀，抽滤，沉淀用甲醇抽提，真空干燥，得到N,O-邻苯甲酰化壳聚糖；2)将1.2g N,O-邻苯甲酰化壳聚糖加入到100ml N,N-二甲基甲酰胺与水的混合溶剂中，N,N-二甲基甲酰胺与水的体积比为95：5，在氮气氛围中加热到120℃，充分搅拌后，将产物置于冰水沉淀，抽滤，用甲醇抽提，真空干燥，得到N-邻苯甲酰化壳聚糖；3)将0.5g N-邻苯甲酰化壳聚糖溶于30ml质量浓度为5％氯化锂的N,N-二甲基乙酰胺溶液，于0℃下预冷，备用；将9.5ml三乙胺和3.6g对甲苯磺酰氯溶于20ml N,N-二甲基乙酰胺溶剂中，然后滴至上述备用的预冷液中，在4-8℃下充分反应，将产物置于冰水中沉淀，过滤，用氯仿洗涤，常温下真空干燥，得到6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚 糖；4)将0.20g 6-对苯磺酸酯基-N-邻苯甲酰化壳聚糖和1.30g叠氮化钠加入到30ml N,N-二甲基甲酰胺中溶解，80℃下充分反应，浓缩后滴加到蒸馏水中沉淀，过滤，真空干燥，得到6-叠氮基-N-邻苯甲酰化壳聚糖；5)称取5g分子量为...
【专利技术属性】
技术研发人员：王征科，陈末童，胡巧玲，唐本忠，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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