生产血小板的射流装置制造方法及图纸

本发明专利技术涉及用于从巨核细胞或其片段的悬液生产血小板的射流装置，其包含生产室，所述生产室包含至少一个通道，其中引导巨核细胞悬液从其进口流至其出口；其中所述通道在其内表面的至少一部分构造成具有多个障碍物。本发明专利技术还涉及用如上定义的射流装置从巨核细胞生产血小板的离体方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及从巨核细胞或其片段生产血小板的改进方法。
技术介绍
血小板是抑制出血关键的小的无核细胞。存在许多血小板生产或功能受损的临床疾病，且需要血小板输液的患者越来越多。目前，解决办法是进行从供血者获得的血小板的输液。用于治疗学应用的离体血小板生产是吸引人的选择，但仍然是主要的技术挑战。血小板来源于巨核细胞。巨核细胞分化是其特征在于顺序步骤的连续过程。尽管巨核细胞分化发生于骨髓中，血小板生产要求巨核细胞片段通入骨髓血管。已经尝试设计尤其致力于血小板生产的生物反应器。国际专利申请WO 2010/06382311公开了从成熟巨核细胞通过使成熟巨核细胞悬液在涂有血管性血友病因子(VWF)的固相上经历剪切率为至少600s-1的流动而生产血小板的离体方法。剪切率影响在Dunois-Lardé等的科学论文(“Exposure of human megakaryocytes to high shear rates accelerates platelet production”,Blood,vol.114,n°9,p.1875-1883,2009)中进一步讨论。然而，产量仍需要改善，以用于可能的治疗学应用。一些出版物提议使用设计为再生天然骨髓环境的3D系统(参见Pallotta等,“Three-Dimensional System for the In Vitro Study of Megakaryocytes and Functional Platelet Production Using Silk-Based Vascular Tubes”,Tissue Engineering:Part C,vol.17,n°12,p.1223-1232,2011,和Sullenbarger等,“Prolonged continuous in vitro human platelet production using three-dimensional scaffolds”,Experimental Hematology,vol.37,n°1,p.101-110,2009)。在这些系统中，细胞片段从其中植入细
胞的支架通过孔隙或管自由迁移进入流动通道。此外，Nakagawa等(“Two differential flows in a bioreactor promoted platelet generation from human pluripotent stem cell-derived megakaryocytes”,Experimental Hematology,2013vol.41,n°8p742-748,2013)最近公开了两种新的模拟微血管的用于血小板生产的生物反应器。它们包含能够捕获巨核细胞的多孔结构或狭缝。施加压力流以确保巨核细胞的固定。此外，将主流垂直施加于压力流或在压流和主流之间具有60°的角度。所述主流将剪切应力施加于捕获的巨核细胞。然而，主流仍然不含巨核细胞。巨核细胞片段经历主流且释放的血小板在主流出口处收集。Thon等(《Platelet bioreactor-on-a-chip》,Blood,vol 124,n°12p1857-1867,2014)描述了基于彼此平行、通过用狭缝刺穿的壁分离的进料通道和主通道流的另一种生物反应器。当进料通道末端关闭时，巨核细胞被推过狭缝。在那里，它们与主流接触并经历剪切应力。在这种系统中，巨核细胞可获得的位点数是有限的，且许多细胞停留在储库中，而最初的巨核细胞伸长并释放血小板。这限制了血小板生产过程的速度。这些系统的几何形状对于快速大规模的生产效率不高。此外，获得的产量仍不够，这是使得血小板功能性表征变得困难的事实。此外，在几小时或几天内进行的实验具有很少评估的内在血小板脱落。已经公开了具有具体结构的微射流装置用于不同的生物学应用。例如，Stott等(“Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip”,PNAS,vol.107,n°43,p.18392-18397,2010)描述了使用其内表面涂有抗体的微射流装置来分离循环肿瘤细胞。内表面中形成凹槽，以便破坏通道内的层流流线，并增加抗体涂层装置中细胞-表面相互作用的数目。类似地，Chang等(“Biomimetic technique for adhesion-based collection and separation of cells in a microfluidic channel”,Lab Chip,vol.5,p.64-73,2005)教导了使用包含微柱阵列的微射流通道来分离和收集细胞。然而，与本专利技术相反，这种微射流装置的目的不是引发血小板从巨核细胞脱落。因此本专利技术的一个目的是提供用于从包含巨核细胞或其片段的细胞悬液生产血小板的射流装置，尤其适用于高产量生产，同时保持新产生的血小板的功能质量。本专利技术的另一个目的是提供适于大规模生产高质量和标准化的血小板的用于生产血小板的方法。专利技术简述在一个方面，本专利技术涉及用于从巨核细胞悬液(5)生产血小板的射流装置(1)，包含：-生产室(3)，包含至少一个通道(8)，其中可以引导包含巨核细胞或其片段的细胞悬液从其进口(9)流至其出口(10)；-任选的流速控制器(7)，用于控制通道(8)中所述悬液的流动；-任选的巨核细胞分拣器和/或混合器(2)，用于富集含巨核细胞的悬液并均质化所述巨核细胞悬液的细胞浓度，其位于生产室(3)的上游；-生产室(3)下游的任选的血小板分拣器(4)，用于通过从巨核细胞或其他细胞残余物分拣血小板来纯化流出悬液(6)；其中至少一部分(11)所述通道(8)的壁的内表面构造成具有多个障碍物。在相关方面，本专利技术涉及用于从包含巨核细胞或其片段的细胞悬液生产血小板的射流装置，包含：-生产室(3)，包含通过非多孔壁定界的至少一个通道(8)和在通道的一端的至少一个进口孔(9)和在通道的另一端的至少一个出口孔(10)，其中可以将包含巨核细胞或其片段的悬液引入进口孔(9)，和其中可以在出口孔(10)收集血小板；-任选的流速控制器(7)，用于控制通道(8)中所述悬液的流动；-任选的巨核细胞分拣器和/或混合器(2)，用于富集含巨核细胞的悬液并均质化所述巨核细胞悬液的细胞浓度，其位于生产室(3)的上游；-生产室(3)下游的任选的血小板分拣器(4)，用于通过从巨核细胞
或其他细胞残余物分拣血小板来纯化流出悬液(6)；其中至少一部分(11)所述通道(8)的壁的内表面构造成具有多个障碍物。在具体的实施方式中，所述多个障碍物分布在二维空间表面，从而形成障碍物的三维阵列。另一方面，本专利技术涉及从巨核细胞或其片段生产血小板的离体方法，所述方法包含：-将包含巨核细胞或其片段的细胞悬液引入如上定义的射流装置；–在生产室的通道中使所述悬液在适于巨核细胞的延伸、破碎和血小板释放的剪切率下流动；和-收集通道出口处的血小板。专利技术详述现在将更详细地描述本专利技术。在以下描述中，应理解表达“-”是指所确定的值的范围，包括下限和上限。本专利技术涉及本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于从巨核细胞悬液(5)生产血小板的射流装置(1)，包含：‑生产室(3)，包含通过非多孔壁定界的至少一个通道(8)，和在一端的其中能引入包含巨核细胞或其片段的悬液的至少一个进口孔(9)，和在另一端的其中可以收集血小板的至少一个出口孔(10)；其中所述通道(8)的壁的内表面的至少一部分(11)构造成具有多个障碍物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.11.19 EP 13306582.11.用于从巨核细胞悬液(5)生产血小板的射流装置(1)，包含：-生产室(3)，包含通过非多孔壁定界的至少一个通道(8)，和在一端的其中能引入包含巨核细胞或其片段的悬液的至少一个进口孔(9)，和在另一端的其中可以收集血小板的至少一个出口孔(10)；其中所述通道(8)的壁的内表面的至少一部分(11)构造成具有多个障碍物。2.根据权利要求1所述的射流装置，其中所述通道(8)的内表面的纹理部分(11)进一步涂有对巨核细胞具有结合亲合力的配体，例如血管性血友病因子(VWF)、其功能性变体或包含血管性血友病因子的片段的重组多肽、或纤维蛋白原或纤连蛋白。3.根据权利要求1或2所述的射流装置，其中确定所述障碍物的密度、尺寸和形状以便将巨核细胞捕获于通道内表面的所述纹理部分上，从而血小板脱落。4.根据权利要求1-3任一项所述的射流装置，其中所述障碍物是杆(12)或束(15)。5.根据权利要求1-4任一项所述的射流装置，其中所述通道(8)具有基本上正方形或长方形的截面。6.根据权利要求1-5任一项所述的射流装置，其中所述障碍物是具有半径为r的基本上圆形截面的杆(12)，且所述杆布置在至少一部分所述通道的内表面上以形成具有六边形的周期性结构的规则图案，例如：(i)杆的半径r优选为50nm-15mm，更优选500nm-1.5mm；(ii)两个杆中心之间的最近距离p为至少等于100nm，优选100nm-50mm，更优选500nm-10mm，甚至更优选5μm-1mm；(iii)角度α，其是通过通道纵向(14)和六边形布拉维晶格的晶格矢量之一定义的最低角度，例如α为0-90°，优选0-30°；(iv)任选所述杆的高度h为如0<h≤H，其中H是指通道截面中
\t两个相对的壁之间...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·巴吕什，A·P·M·布林，A·马涅，S·沙萨克，A·勒格夫，M·雷萨特，
申请(专利权)人：普拉托德公司，巴黎市工业物理化学学校，
类型：发明
国别省市：法国;FR