一种检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的方法及其试剂盒技术

本发明专利技术公开了一种检测A1和A2型荷斯坦牛的方法及其试剂盒，属于分子生物学检测技术领域，该方法以待测牛的DNA为模板设计专用引物，进行PCR扩增反应，扩增片段经EcoT22I酶切后进行琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶检测DNA片段长度为434bp的牛为A1型牛；酶切后DNA片段为434bp、385bp和49bp为A1和A2杂合型牛；酶切后DNA片段为385bp和49bp为A2型牛。该检测方法操作便捷、成本低、准确性高，可以早期筛选A2型奶牛，减少养牛业的经济损失。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学检测
，具体涉及一种检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的方法及其试剂盒。
技术介绍
牛奶品质是奶业发展的生命，影响奶业的健康可持续发展。乳蛋白是构成牛奶品质的主要物质基础，牛奶中的乳蛋白以酪蛋白和乳清蛋白为主。酪蛋白约占牛奶蛋白的80％，包括alpha s1，alpha s2，beta，kappa四种类型。其中β酪蛋白约占蛋白质总量的30％，是氨基酸的重要来源，研究报道β-酪蛋白有A1，A2，A3，A4，B，C，D，E,F，H1，H2，I，G共13种遗传变体型(Kamiński等，2007)。A1和A2型β-酪蛋白是奶牛群体中最常见的两种，其区别在于β-酪蛋白基因发生了一个碱基变化，从而导致相应位置氨基酸由脯氨酸变成组氨酸。研究发现，正是由于上述一个氨基酸的变化，导致了牛奶在人类消化过程中产生了差异。A1型牛奶在消化或鲜奶加工过程中某些酶可在其组氨酸处特异性水解，从而形成一种由七个氨基酸组成的肽段，被称为β-酪啡肽(BCM-7)，而A2型β酪蛋白此处氨基酸为脯氨酸，不能够被特异性水解，因此不能形成BCM-7。现已发现，BCM-7能穿过胃肠壁进入血液循环，影响消化系统和免疫细胞，可能与一些疾病有关，如Ⅰ型糖尿病、呼吸功能障碍、消化系统疾病、免疫功能紊乱和突然性婴儿死亡综合征等。近日，国内最新研究成果显示，很多人对乳糖不耐受的认知存在误区，其实导致他们一喝牛奶就出现肠道反应的原因有可能是因为肠道对普通牛奶中含有的A1蛋白质所产生的炎症反应而引起的。目前，全球只有新西兰建立了一家有权生产和销售A2品牌乳制品的公司，其所有的A2牛奶都是通过DNA测序验证。2013年11月，A2有限公司首次向中国消费者推出其A2Platinum白金婴幼儿配方奶粉系列产品，也在积极拓展在北美及亚洲的其他市场。可以说A2品牌的出现是科研到商业开发的一次成功性突破。随着A1、A2牛奶相关知识的宣传和报道，以及食品安全越来越受到关注，A2奶将会更多地受到消费者的青睐。因此，有必要提供一种有效区分A1型和A2型β-酪蛋白奶牛的方法。中国专利CN1052919839A公开了一种基于酶切法检测β-酪蛋白基因型的方法，该方法是根据β-酪蛋白的碱基序列设计出可以扩增出TaqI酶切位点的引物，利用引物对待检测的奶牛基因组DNA进行PCR扩增，扩增出的A1型β-酪蛋白基因片段中产生一个TaqI酶切位点，利用限制性内切酶TaqI对扩增产物进行酶切，根据琼脂糖凝胶电泳的结果进行判
断，含有A1型β-酪蛋白基因的扩增产物在酶切之后就会产生一个218bp的片段和一个35bp的小片段。该方法虽然可以实现β-酪蛋白基因型的检测，但是该方法在设计上游引物时，创造酶切的突变位点位于该引物的最后一个碱基，从该专利的琼脂糖凝胶电泳图可以看出，酶切后有许多其它电泳条带存在，比较杂乱，可能存在非特性扩增现象，且酶切后小片段的长度只有35bp，片段间长度差别太小，这些问题都极易导致出现假阳性或假阴性的检测结果。因此，需要针对引物创造性酶切位点的位置、扩增条件及酶切体系做相应的改善，以满足快速检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的需要。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术人经过创造性的劳动和大量的试验，得到了能够用于检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的方法及其试剂盒，所述检测方法及其试剂盒的特异性强、灵敏度高，能够快速、准确的检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛。由此提供了下述专利技术：本专利技术的一个方面涉及一种用于检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的引物，所述引物的序列如下：beta-caseinF：5'-CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC-3'(SEQ ID NO.1)；beta-caseinR：5'-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3'(SEQ IDNO.2)。采用上述引物对目的基因进行扩增，若PCR扩增片段的第49为CC，为A1型牛，PCR扩增片段的序列如SEQ ID NO.3所示；若PCR扩增片段的第49为AA，为A2型牛，PCR扩增片段的序列如SEQ ID NO.4所示；若扩增片段序列中第49位C和A碱基都存在，则为A1和A2杂合牛。上述引物在制备检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的试剂或试剂盒中的应用也是本专利技术的保护范围。本专利技术的引物设计思路为：基于beta-casein基因(Ensembl参考序列ENSBTAT00000003409)c.245C>A突变，并利用PCR-RFLP技术在上游引物(beta-caseinF)上创造了一个突变位点，设计得到可以扩增产生EcoT22I酶切位点的引物。需要说明的是，本专利技术中引物的设计除了通常引物设计所要考虑的退火温度、GC含量等方面，更要考虑两个重要因素：(1)上游引物所创造的突变位点位置的选择；(2)酶切后反应产物片段的大小；若酶切后的反应产物的片段过小，则在进行凝胶电泳检测时，条带间显
示不清晰或无法区分显示，容易出现假阳性或假阴性的检测结果，但扩增产物也不宜过长，过长则会影响扩增的效率。本专利技术针对上游引物选择了不同的突变位点，以及酶切后扩增产物片段的长度，设计了多对引物，经过试验反复验证后确定本专利技术上述所列出的用于检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的引物为最佳引物，能够兼顾检测的准确性、特异性和扩增效率的需要。其他引物则难以实现检测准确性和扩增效率的兼顾。本专利技术的另一方面涉及一种用于检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的试剂盒，其包含本专利技术的上述引物。上述试剂盒中，还包含Taq Master Mix、EcoT22I酶、Buffer缓冲液和DNA Marker。所述Taq Master Mix是由Taq DNA Polymerase(0.05units/μl)、MgCl2(4mM)、和dNTPs(0.4mM)构成。在本专利技术的一个具体实施方式中，所述试剂盒中包含：上述引物(10μmol/L)；2×Taq Master Mix；10×H Buffer缓冲液；EcoT22I酶；灭菌水；2000bp DNA Marker。本专利技术的再一方面涉及一种非诊断目的的检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的方法，包括采用上述引物对待测样品的目的基因进行PCR扩增的步骤，对PCR扩增产物进行酶切反应的步骤，以及对酶切后的片段进行凝胶电泳检测的步骤。所述PCR扩增采用25μl反应体系，反应体系的组成为：模板DNA(100ng/μl)1μl，上游引物beta-caseinF(10μmol/L)、下游引物beta-caseinR(10μmol/L)各0.5μl，2×Taq MasterMix 12.5μl，灭菌水10.5μl。所述PCR扩增的反应条件为：94℃预变性4min；然后94℃变性30s，67℃退火30s，72℃延伸10s，此步共35个循环；72℃保持5min。所述酶切反应采用20μl酶切反应体系，反应体系的组成为：PCR扩增产物10μl；10×HBuffer缓冲液2μl；EcoT22I酶1μl；灭菌水7μl。所述酶切反应的反应条件为：37℃消化60min。所述凝胶电泳检测的步骤具体为：将酶切后的片段用质本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测A1和A2型β‑酪蛋白奶牛的引物，其特征在于，所述引物的序列为：beta‑caseinF：5'‑CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC‑3'；beta‑caseinR：5'‑CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC‑3'。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的引物，其特征在于，所述引物的序列为：beta-caseinF：5'-CCTTTGCCCAGACACAGTCTCTAGTCTATCCCTTCCCTGGGCCCATGC-3'；beta-caseinR：5'-CTCCTGGTACAGCAGAAAGGCCTGAATGGGCATATCTC-3'。2.权利要求1所述的引物在制备检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的试剂或试剂盒中的应用。3.一种用于检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的试剂盒，其包含权利要求1所述的引物。4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中，还包含Taq Master Mix、EcoT22 I酶、Buffer缓冲液和DNA Marker。5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述Taq Master Mix是由Taq DNA Polymerase(0.05units/μl)、MgCl2(4mM)、和dNTPs(0.4mM)构成。6.一种非诊断目的的检测A1和A2型β-酪蛋白奶牛的方法，其特征在于，包括采用权利要求1所述的引物对待测样品的目的基因进行PCR扩增的步骤，对...

【专利技术属性】
技术研发人员：王秀革，黄金明，都彦伶，姜强，张燕，鞠志花，王长法，孙艳，仲跻峰，
申请(专利权)人：山东省农业科学院奶牛研究中心，
类型：发明
国别省市：山东;37