一种巴西绿蜂胶质量控制方法技术

本发明专利技术提供一种巴西绿蜂胶质量控制方法，通过以下步骤实现：用乙醇超声提取供试蜂胶样品，过滤，用高效液相色谱检测，根据标准曲线计算6个评价指标成分含量，以这6个成分的含量高低评价巴西绿蜂胶的质量优劣，即这6个成分的含量总和大于10％为优质蜂胶，小于6％为劣质蜂胶。本发明专利技术将巴西绿蜂胶化学成分与抗氧化活性相结合，阐明了巴西绿蜂胶抗氧化物质基础，避免了某些主要成分并未发挥较强的药理活性的弊端，更能真实反应巴西绿蜂胶的抗氧化活性。本发明专利技术方法设计合理，克服现有巴西绿蜂胶以总黄酮为质控指标的不合理性，以及克服多个黄酮或酚酸类含量检测与活性无相关性等缺陷，为巴西绿蜂胶质量控制提出一种新的方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于蜂胶质量控制领域，涉及一种巴西绿蜂胶质量控制方法。
技术介绍
巴西绿蜂胶采自巴西东南部和中西部地区，其植物来源是Baccharis dracunculifolia DC.，是目前国内外商业上最流行、研究最多的蜂胶类型之一，现已广泛应用于保健食品中来改进人类健康和预防疾病。巴西绿蜂胶进口至中国已有十余年历史，由于缺少质量评价方法，只能参照中国蜂胶的国家标准，以总黄酮含量作为质控指标。而巴西绿蜂胶主要成分为异戊烯苯丙类和p-香豆酸的异戊烯基衍生物，黄酮类化合物含量较低。显然以总黄酮含量为指标不适合巴西绿蜂胶质量控制。目前关于巴西绿蜂胶中黄酮类、酚酸类的含量检测以及指纹图谱的研究较多。然而，在不同的检测条件下所用指标及建立的指纹图谱各不相同，再加上蜂胶中不同化学成分所发挥的药理活性并不相同，目前，巴西绿蜂胶的质控方法与其疗效无相关性，难以达到确保蜂胶有效性和药效稳定性的目的。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种巴西绿蜂胶质量控制方法，通过以下步骤实现：1.蜂胶样本制备对供试样品进行冷冻粉碎后，用70～95％乙醇超声提取15～45min，料液比为1:10～30，反复提取3次，合并滤液，经冷冻除蜡后用95％的乙醇定容至50mL，经微孔膜过滤得R1检测样本液；2.高效液相色谱法检测检测条件：Sepax HP-C18(150mm*4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-0.1％乙酸；流速：1.0mL/min；波长：280nm，柱温：33℃，进样量：5μL，优化后的梯度洗脱程序为：0-10min，15-25％甲醇；10-25min，25-40％甲醇；25-55min，40-60％甲醇；55-75min，60-75％甲醇；75-90min，75-85％甲醇；3.质量评价根据标准曲线和峰面积，计算出绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4,5-三咖啡酰奎宁酸和阿替匹林C的含量，以这6个成分的含量高低评价巴西绿蜂胶的质量优劣，即这6个成分的含量总和大于10％为优质蜂胶，小于6％为劣质蜂胶。本专利技术的另一个目的是提供所述的方法在评价巴西绿蜂胶质量中的应用。所述的巴西绿
蜂胶质量评价方法所采用的活性指标成分为绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4,5-三咖啡酰奎宁酸和阿替匹林C，当这6个成分的含量总和大于10％为优质蜂胶，小于6％为劣质蜂胶。本专利技术克服巴西绿蜂胶质量控制中采用总黄酮或单个黄酮或酚酸的仅以化学成分信息进行质控的弊端，提供了一种以抗氧化活性成分来评价巴西绿蜂胶质量优劣的评价方法。与现有的巴西绿蜂胶质量控制方法相比，本专利技术具有下述特点：(1)明确巴西绿蜂胶抗氧化活性成分，以抗氧化活性成分为指标能够反应巴西绿蜂胶的抗氧化活性强弱。(2)以抗氧化活性成分为指标，更能真实地体现巴西绿蜂胶的药理活性。本专利技术将巴西绿蜂胶化学成分与抗氧化活性相结合，阐明了巴西绿蜂胶抗氧化物质基础，避免了某些主要成分并未发挥较强的药理活性的弊端，更能真实反应巴西绿蜂胶的抗氧化活性。本专利技术方法克服现有巴西绿蜂胶以总黄酮为质控指标的不合理性，以及克服多个黄酮或酚酸类含量检测与活性无相关性等缺陷，为巴西绿蜂胶质量控制提出一种新的方法。附图说明图1是巴西绿蜂胶与DPPH自由基反应前(a)与反应后(b)HPLC对比模式图谱：1、绿原酸；2、咖啡酸；3、3,5-二咖啡酰奎宁酸；4、4,5-二咖啡酰奎宁酸；5、3,4,5-三咖啡酰奎宁酸；6、阿替匹林C。具体实施方式本专利技术结合具体实施例作进一步的说明。实施例1(1)蜂胶样本制备取不同批次的3个巴西绿蜂胶样，冷冻粉碎后，用95％乙醇超声提取30min，料液比为1:15，反复提取3次，合并滤液，经冷冻除蜡后用95％的乙醇定容至50mL，经微孔膜过滤分别得S1、S2、S3检测样本液。(2)高效液相色谱检测条件：Sepax HP-C18(150mm*4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-0.1％乙酸；流速：1.0mL/min；波长：280nm。柱温：33℃。进样量：5μL。优化后的梯度洗脱程序为：0-10min，15-25％甲醇；10-25min，25-40％甲醇；25-55min，40-60％甲醇；55-75min，60-75％甲醇；75-90min，75-85％甲醇。(3)离线HPLC-DPPH分析分别移取S1、S2、S3蜂胶醇提液，加入新鲜配置的DPPH乙醇溶液，室温条件下避光反应一段时间，经滤膜过滤后作为实验组；同时用等体积的无水乙醇替代DPPH按上述操作处理
作为空白对照样。分别进供试样和空白对照各5μL，进行HPLC分析。由图1可知，反应后蜂胶中的成分峰1(绿原酸)、2(咖啡酸)、3(3,5-二咖啡酰奎宁酸)、4(4,5-二咖啡酰奎宁酸)、5(3,4,5-三咖啡酰奎宁酸)、6(阿替匹林C)的峰面积发生了显著的下降，而其他成分峰在反应后无明显的下降。表1 巴西绿蜂胶中共有成分的峰面积下降率峰面积下降率S1S2S3P149.82±6.9951.64±4.3760.69±3.62P245.65±4.2548.12±1.5452.96±2.04P376.57±1.3877.90±1.7378.44±2.48P477.08±5.3077.82±3.7381.24±6.71P588.25±3.9280.70±1.2988.80±2.01P647.53±5.3733.43±0.6844.69±2.38根据反应后蜂胶中抗氧化成分的峰面积下降率定量评价各活性成分的效价值，山奈酚>3,4,5-三咖啡酰奎宁酸>3,5-二咖啡酰奎宁酸≥4,5-二咖啡酰奎宁酸>桦木酚>>绿原酸>咖啡酸>阿替匹林C。因此，可根据本专利技术建立的HPLC方法测定抗氧化活性成分的含量来评价巴西绿蜂胶抗氧化活性的高低，从而评价其质量优劣。(4)巴西绿蜂胶抗氧化活性质量评价根据标准曲线计算绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁酸、4,5-二咖啡酰奎宁酸、3,4,5-三咖啡酰奎宁酸和阿替匹林C的含量，如表2所示，这6个成分的含量与巴西绿蜂胶的抗氧化活性成正相关，三个样本总抗氧化活性成分含量均介于6％～8％之间，表现了一般的抗氧化活性。表2 巴西绿蜂胶抗氧化活性成分含量(mg/g)与抗氧化活性(IC50,μg/mL)实施例2(1)蜂胶样本制备取不同批次的3个巴西绿蜂胶样，冷冻粉碎后，用70％乙醇超声提取45min，料液比为1:30，
反复提取3次，合并滤液，经冷冻除蜡后用95％的乙醇定容至50mL，经微孔膜过滤分别得S4、S5、S6检测样本液。(2)高效液相色谱检测条件Sepax HP-C18(150mm*4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-0.1％乙酸；流速：1.0mL/min；波长：280nm。柱温：33℃。进样量：5μL。优化后的梯度洗脱程序为：0-10min，15-25％甲醇；10-25min，25-40％甲醇；25-55min，40-60％甲醇；55-75min，60-75％甲醇；75-90min，75-85％甲醇。(3)巴西绿蜂胶抗氧化活性质量评价根据标准曲线计算绿原酸、咖啡酸、3,5-二咖啡酰奎宁本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种巴西绿蜂胶质量控制方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)蜂胶样本制备对供试样品进行冷冻粉碎后，用70～95％乙醇超声提取15～45min，料液比为1:10～30，反复提取3次，合并滤液，经冷冻除蜡后用95％的乙醇定容至50mL，经微孔膜过滤得R1检测样本液；(2)高效液相色谱检测检测条件：Sepax HP‑C18(150mm*4.6mm,5μm)；流动相：甲醇‑0.1％乙酸；流速：1.0mL/min；波长：280nm。柱温：33℃。进样量：5μL，梯度洗脱程序为：0‑10min，15‑25％甲醇；10‑25min，25‑40％甲醇；25‑55min，40‑60％甲醇；55‑75min，60‑75％甲醇；75‑90min，75‑85％甲醇；(3)质量评价根据标准曲线和峰面积，计算出绿原酸、咖啡酸、3,5‑二咖啡酰奎宁酸、4,5‑二咖啡酰奎宁酸、3,4,5‑三咖啡酰奎宁酸和阿替匹林C的含量，以这6个成分的含量高低评价巴西绿蜂胶的质量优劣，当6个成分的含量总和大于10％为优质蜂胶，小于6％为劣质蜂胶。

【技术特征摘要】
1.一种巴西绿蜂胶质量控制方法，其特征在于，通过以下步骤实现：(1)蜂胶样本制备对供试样品进行冷冻粉碎后，用70～95％乙醇超声提取15～45min，料液比为1:10～30，反复提取3次，合并滤液，经冷冻除蜡后用95％的乙醇定容至50mL，经微孔膜过滤得R1检测样本液；(2)高效液相色谱检测检测条件：Sepax HP-C18(150mm*4.6mm,5μm)；流动相：甲醇-0.1％乙酸；流速：1.0mL/min；波长：280nm。柱温：33℃。进样量：5μL，梯度洗脱程序为：0-10min，15-25％甲醇；10-25min，25-40％甲醇；25-55min，40-60％甲醇；55-75min，60-7...

【专利技术属性】
技术研发人员：张翠平，胡福良，申小阁，刘嘉，
申请(专利权)人：浙江大学，蜂乃宝本铺南京保健食品有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33