本发明专利技术公开了一种甲状腺过氧化物酶表达方法，采用传统杆状病毒表达系统外，还采用家蚕（Bombyx mori）生物反应器表达系统对TPO进行表达，家蚕生物反应器作为新型杆状病毒表达系统，在医药制备方面发挥了重大的作用，展示了广阔的应用前景，方法成功构建了带有绿色荧光基因的杆状病毒转移载体pFBDMY‑IG‑TPO，利用Tn7转座位点分别转座到带有病毒基因组的asd基因缺失的大肠杆菌受体菌AcMultiBac/rSW106‑inv+asd‑和BmMultiBac/rSW106‑inv+asd‑中，用重组AcMultiBac/rSW106/pFBDMY‑IG‑TPO菌液感染昆虫细胞Spodoptera frugiperda 9（Sf9），得到重组病毒Ac/TPO‑IG，利用家蚕幼虫或蚕蛹表达蛋白，不仅显著降低成本、增加蛋白表达量，活性也大大提高。
【技术实现步骤摘要】
201610246851
【技术保护点】
一种甲状腺过氧化物酶表达方法，其特征在于按下述步骤操作：1）.TPO基因的克隆①引物设计合成，上游添加EcoR V、EcoR I位点，下游添加Sal I位点，TPOE5E1: aagatatcggaattctggcctgcacagaagccttcTPOSalR: aagtcgacttagtgatggtgatggtgatg；②TPO 用LaTaq酶 PCR扩增；③琼脂糖电泳检测，检测正确者用胶回收试剂盒回收；2）. T载体连接、转化、测序验证为了方便测序检测扩增序列是否正确，将PCR回收产物连接到到pBackzero‑T载体上；连接；②转化到TOP10感受态细胞中，在含有Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落；③菌液PCR验证；④酶切验证，PCR验证阳性的克隆，提质粒做酶切验证；⑤测序，酶切验证正确的T‑TPO；3）. 转移载体pFBDMY‑TPO‑IG的构建质粒pFBDMY‑IRES‑eGFP是先缺失原始pFBDM 中MSC1上的Spe I位点，命名为pFBDMY，后又在BstB I和Pst I位点之间插入IRES和eGFP基因， IRES（internal ribosome entry site）基因，即内部核糖体进入位点，是mRNA分子内（而非5'端）可被核糖体识别并启动翻译的一种顺式元件，eGFP转移到病毒基因组表达产生绿色荧光蛋白，在病毒转染和感染时起报告基因的作用，IRES有助于eGFP蛋白的表达；将测序正确的T‑TPO和pFBDMY‑IRES‑eGFP分别用EcoR I/Sal I 酶切，回收，连接，PCR验证，酶切验证，连接体系由如下试剂构成：载体回收1µL、片段回收4µL、Solution I 5µL，连接混合物16℃反应3 h，其余与T载体的构建方法相同；4）. Tn7位点的转座制备AcMultiBac/rSW106‑inv+asd‑和BmMultiBac/rSW106‑inv+ asd‑转座感受态；转座；5）.重组病毒菌液感染Sf9昆虫细胞将构建的pFBDMY‑TPO‑IG/rSW106‑inv+asd‑ 重组病毒菌液，按照下面的方法感染Sf9昆虫细胞：将PCR验证阳性的AcMultiBac/pFBDMY‑TPO‑IG/rSW106‑inv+asd‑ 重组病毒菌液（2~3个菌落）接种到5 mL含Kan/Tet/Gm/Spe/DAP的LB培养基，于32℃200 rpm振荡培养过夜；无菌条件下分别取1 mL菌液至灭菌的1.5 mL Eppendorf管，5000 rpm离心3 min，弃上清，用无菌水重悬洗涤三次，洗掉菌液中DAP；最后无菌条件下用1 mL无血清无双抗的Grace培养基重悬沉淀，再用双无Grace培养基稀释成10‑2、10‑3，以六孔板为例，前一天将生长状态良好的Sf9细胞转移到六孔板，隔夜培养，细胞密度为70%~80%时，吸出培养基，每孔加入1 mL双无Grace（无血清，无双抗）稀释后的菌液，做好标记，四小时后，吸走上清，加入l mL完全Grace培养基，三天后荧光检测；②将前一步骤①中获得的细胞上清作为P1代重组杆状病毒，连续传代P1代病毒，获得P2、P3代重组杆状病毒；重组病毒菌液注射家蚕或重组病毒口服感染家蚕，生产重组病毒粒子Bm/TPO‑IG和Bm/TPO‑IG/IH。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：姚伦广，王铁军，阚云超，胡小敏，郭保党，吕慧芳，邢秋婷，王立方，
申请(专利权)人：南阳师范学院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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