用于肉制品中掺假马源性成分快速鉴别的锁核酸探针荧光定量PCR方法及其引物和锁核酸探针序列技术

马源性成分锁核酸荧光定量PCR检测方法及其引物和锁核酸探针。本发明专利技术涉及将锁核酸探针技术应用于马源性成分的快速鉴别，建立的锁核酸荧光定量PCR方法具有快速、敏感、特异等优点，适应于肉制品中掺假马源性成分的快速检测。本发明专利技术包括引物和锁核酸序列的设计及锁核酸荧光定量PCR方法的建立。上游引物序列为：5’-CCCACTATCAGGATTCATACCC -3’；下游引物序列为：5’- AGTGAGGTGGAATAGGTTAGTCG -3’；锁核酸探针序列为：5’- FAM-ACACCAAAAATAGCAGCATCATCCTCC-BHQ1-3’锁核酸荧光定量PCR检测方法的反应体系为：20μL，包括10μL Probes Master 2×conc(包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶等)，10μmol/L上述上下游引物F/R 各0.4μL，10μmol/上述锁核酸探针P 0.3μL，DNA 模板1μL，超纯水补至20μL。反应参数：95℃ 8min； 95℃，10s，58℃，30s（收集荧光信号），35～40个循环。

【技术实现步骤摘要】


本专利技术涉及动物源性成分鉴定
，具体涉及用锁核酸探针技术检测肉制品中掺假马源性成分的方法及其引物和锁核酸探针序列。

技术介绍

一些不法商家为牟取暴利，在标明某肉的肉制品中掺入低价位其它肉类，如在牛肉丸中掺入猪肉，在牛肉制品中掺入马肉等，极大地损坏了消费者的利益。在我国，媒体已多次曝光假冒牛羊肉卷事件。在瑞典、英国和法国等西方国家，也多次曝光用马肉假冒牛肉事件。BALLIN等对近千种肉制品的检测分析发现，有近20%的产品存在标识与品种不完全相符现象。目前，打击肉制品掺假已成为社会关注的热点，而对肉制品中动物源性成分的快速鉴别是打假的重要技术手段。
对肉制品的掺假检测主要基于对动物源性成分的鉴别，尽管动物源性成分鉴别有多种方法，但以检测DNA为基础的分子生物学方法，尤其是PCR技术以稳定、准确、快速等优势而得到越来越广泛的应用。然而，食品中DNA成分复杂，加之PCR技术的高灵敏度，使得应用PCR方法来鉴别物种存在因非特异性扩增而产生假阳性结果的缺点。因此，以PCR为基础，应用改良的引物探针设计策略已逐步成为肉类鉴别的新方向。关于马源性成分的检测鉴定研究报道不多，李爱民等建立的羧化胶乳凝集抑制试验虽成本低、操作简便，但不适合熟制马肉的检测。郑光明等建立了普通PCR鉴定马肉的方法，该法使熟制马肉制品的鉴别成为可能，但该法存在普通PCR的缺点如易产生交叉污染、有触毒风险等。李楠等建立了实时荧光PCR方法，实现了肉制品中马源性成分的快速检测，但该法还有瑕疵，如与牛源性成分有一定交叉反应，设定以Ct值＜30判为阳性，存在将非特异性反应误判为阳性和将生产加工、销售过程肉污染误判为故意掺假的可能。
锁核酸探针是在Taqman探针的基础上，有目的地将探针的一些碱基修饰成LNA碱基，通过提高探针的Tm值，缩短探针长度来增加探针的稳定性、特异性和设计的灵活性。本专利技术利用锁核酸探针的上述优点，建立检测肉制品中掺假马源性成分的锁核酸探针荧光定量PCR方法，通过采用样品Ct值与纯马肉Ct值的绝对差值作为肉制品中马肉掺假的判定标准，解决了肉污染引起的掺假误判和非特异性反应引起的假阳性。

技术实现思路

本专利技术的目的是提供一种用于肉制品中掺假马源性成分快速鉴别的锁核酸探针荧光定量PCR方法及其引物和锁核酸探针序列。包括：
⑴所述的引物和锁核酸探针的序列：
上游引物序列为：5’-CCCACTATCAGGATTCATACCC-3’；
下游引物序列为：5’-AGTGAGGTGGAATAGGTTAGTCG-3’；
锁核酸探针序列为：
5’-FAM-ACACCAAAAATAGCAGCATCATCCTCC-BHQ1-3’
(2)采用步骤(1)设计的引物和锁核酸探针建立马源性成分的锁核酸探针荧光定量PCR检测方法。其特征在于：锁核酸探针荧光定量PCR检测方法的反应体系为：20μL，包括10μLProbesMaster2×conc(包含有dNTP，Mg2+以及Taq酶等)，10μmol/L上述上下游引物F/R各0.4μL，10μmol/上述锁核酸探针P0.3μL，DNA模板1μL，超纯水补至20μL。反应参数：95℃8min；95℃，10s，58℃，30s（收集荧光信号），35～40个循环。试验设纯马肉DNA阳性对照和空白对照。阳性对照Ct值≤20，且有明显扩增曲线，空白对照无Ct值，试验有效，可进行结果判定。样品无Ct值，或Ct（样品）＞30，或｜Ct（样品）-Ct（阳性）｜＞7，且样品无明显扩增曲线的，判为阴性，报告样品不含马源性成分；｜Ct（样品）-Ct（阳性）｜≤7，且样品扩增曲线明显呈对数增长，判为阳性，报告样品中掺有马源性成分；｜Ct（样品）-Ct（阳性）｜＞7，Ct（样品）＜30，且扩增曲线明显呈对数增长，判为假阳性，报告样品污染马源性成分。
基于本专利技术建立的锁核酸探针荧光定量PCR检测方法，按下列步骤进行：
1）样品的制备与DNA模板的提取：
取肉制品25g，剪碎后，加去离子水制成1:4匀浆，吸取匀浆50μL于1.5mL离心管内，按组织核酸提取（离心柱法）试剂盒使用说明操作，提取DNA备检。
2）将试剂从冰箱取出后，置室温融化，8000rpm离心10s。根据样品数按下表计算试剂用量。
试剂名称Probes Master 2×conc.上、下游引物探针去离子水用量μL10×n0.4×n0.3×n8.3×nn=1(阴性对照)+1（阳性对照）+样品数+损耗数
将上述ProbesMaster2×conc.，上、下游引物，探针和去离子水分别加入离心管中，混匀后，8000rpm离心10s。向设定的反应孔加入19μL/孔。
3）加样：
将马肉DNA加入阳性对照孔、将去离子水加入阴性对照孔、将样品DNA分别加入样品反应孔，1μL/孔。用反应膜封住反应孔，置于荧光定量PCR仪上检测。
4）反应参数设置：95℃8min；95℃，10s，58℃，30s（采集荧光信号），35～40循环。
5）结果判断：
（1）质控标准
——阴性对照：无Ct值或Ct值＞30，且无典型扩增曲线；
——阳性对照：Ct≤20，且扩增曲线明显呈对数增长。
阴性和阳性对照满足质控标准，实验有效，可进行结果判定。
（2）判定和报告
样品无Ct值，或Ct（样品）＞30，或｜Ct（样品）-Ct（阳性）｜＞7，且样品无明显扩增曲线的，判为阴性，报告样品不含马源性成分。
｜Ct（样品）-Ct（阳性）｜≤7，且样品扩增曲线明显呈对数增长，判为阳性，报告样品掺有马源性成分。
｜Ct（样品）-Ct（阳性）｜＞7，Ct（样品）＜30，且扩增曲线明显呈对数增长，判为假阳性，报告样品污染马源性成分。
本专利技术具有下列优点。
1本专利技术提供的引物和锁核酸探针具有良好的检测灵敏度和特异性。
2本专利技术建立了用于快速检测肉制品中马源性成分掺假的锁核酸探针荧光定量PCR方法。该法提出以样品Ct值与阳性对照Ct值的绝对差值作为掺假成分阳性判定标准，解决了生产加工和销售过程中肉污染造成的掺假误判和其他肉类非特异性反应造成的假阳性问题。
3本专利技术为其他动物源性成分的检测探索了新的途径。
附图说明
图1马源性成分锁核酸探针荧光定量PCR检测方法特异性试验扩增曲线图
其中图中1为马源性成分；2—12为牛、羊、猪、驴、鹿、驴、鸡、鸭、鹅、虾肉源性成分和阴性对照。
图2马源性成分锁核酸探针荧光定量PCR检测方法灵敏性扩增曲线图，其中图中：1-7的DNA浓度分别为：140ng、14ng、1.4ng、0.14ng、0.014ng、0.0014ng、0.00014ng；8为阴性对照。
具体实施方式
以下实施例子是对本专利技术作进一步详述。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。
实施例1：特异性试验
检测设备：LightCycler?480型荧光定量PCR仪（Roche），高速离心机（Beckman），恒温干热器（Eppendorf）。
检测试剂：核酸提取（离心柱法）试剂盒由达安公司提供，ProbesMaster2×conc.由Roche公司提供，上、下游引物和锁核酸探针由上海辉睿公司合成标记。具体序列如本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于肉制品中掺假马源性成分快速鉴别的锁核酸探针荧光定量PCR的引物序列和探针序列，其特征是所述引物序列包括：上游引物序列为：5’‑CCCACTATCAGGATTCATACCC ‑3’；下游引物序列为：5’‑ AGTGAGGTGGAATAGGTTAGTCG ‑3’；所述锁核酸探针序列为：5’‑ FAM‑ACACCAAAAATAGCAGCATCATCCTCC‑BHQ1‑3’。

【技术特征摘要】
1.用于肉制品中掺假马源性成分快速鉴别的锁核酸探针荧光定量PCR的引物序列和探针序列，其特征是所述引物序列包括：
上游引物序列为：5’-CCCACTATCAGGATTCATACCC-3’；
下游引物序列为：5’-AGTGAGGTGGAATAGGTTAGTCG-3’；
所述锁核酸探针序列为：
5’-FAM-ACACCAAAAATAGCAGCATCATCCTCC-BHQ1-3’。2.用于肉制品掺假马源性成分快速鉴别的锁核酸探针荧光定量PCR方法，其特征在于包括如下步骤：
⑴设计引物和锁核酸探针的序列：
上游引物序列为：5’-CCCACTATCAGGATTCATACCC-3’；
下游引物序列为：5’-AGTGAGGTGGAATAGGTTAGTCG-3’；
锁核酸探针序列为：
5’-FAM-ACACCAAAAATAGCAGCATCATCCTCC-BHQ1-3’；(2)采用步骤(1)设计的引物和探针建立马源性成分的锁核酸荧光定量PCR检测方法；...

【专利技术属性】
技术研发人员：许如苏，周广彪，陈冠武，利光辉，刘中勇，段建发，魏霜，
申请(专利权)人：中华人民共和国汕头出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：广东;44